多浪羊IFN－γ基因克隆及核苷酸序列分析

左文斌 潘 輝 李蓮瑞

干擾素(IFN－γ)是具有正常生理功能的細胞在適宜的誘生劑的作用下產生的能夠抑制病毒增殖的一類重要細胞因子，其化學本質是一種糖蛋白，具有廣譜抗病毒、抗細胞分裂增殖及免疫調節等多種生物學功能［1］。干擾素具有抑制細胞增生、免疫調節及抗炎癥活性，因而對宿主防御機制很重要。

隨著病原菌新毒株、變異株的不斷出現，我國動物疾病的防治面臨嚴峻的挑戰。自發現干擾素以來，干擾素已經顯示出極強的抗病毒、抗腫瘤以及免疫調節活性和應用前景，干擾素的研究越來越受到人們的廣泛關注［2］。目前干擾素在基礎理論和實踐應用上仍需要進行大量的研究，通過對多浪羊IFN－γ基因的克隆與序列分析，能夠為多浪羊IFN－γ的功能研究和免疫應答相關基因的篩選奠定基礎，為IFN－γ基因工程藥物的生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

多浪羊由塔里木大學動物科學學院提供;DH5α感受態細胞本實驗室制作保存;Trizol Reagent購自Invitrogen公司;RT－PCR試劑盒、pMD18－T載體、DL2000 DNA Marker、限制性內切酶EcoR I和Xho I購自大連寶生物工程有限公司;DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自杭州愛思進生物技術有限公司;其它試劑由本實驗室配制。

1.2 方法

1.2.1 總 RNA 提取

無菌采集多浪羊羊外周血20 mL，加入3.8%枸櫞酸鈉抗凝。然后參照賀艷艷［3］等分離淋巴細胞的方法，分離淋巴細胞。按Invitrogen Trizol試劑說明書提取總RNA，置于－70℃保存備用。

1.2.2 引物設計

根據 GenBank上的 IFN－γ基因序列 NM_001009803設計引物:

上游引物為 5’－GGCCTCGAGAGGCAGGAGAACCATTAC －3’，

下游引物為5’－GGCGAATTCCACAGGAGCTACCGATTT －3’。

1.2.3 兩步法擴增IFN－γ基因

采用使用Invitrogen公司的SuperScript cDNA First－strand Synthesis System進行逆轉錄。反應產物保存于－20℃備用。

PCR反應體系:10×one step RT－PCR buffer 2 μL，dNTP1.6 μL，Taq DNA 聚合酶 0.4 μL，PF(20 pmol/ μL)0.5 μL，PR(20 pmol/ μL)0.5 μL，模板 cDNA 0.5 μL，ddH2O 14.5 uL

PCR反應條件:95℃ 5 min;然后94℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃ 40 s 35個循環;72℃ 10 min，4℃保存。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳鑒定RT－PCR結果

采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測RT－PCR結果。

1.2.5 IFN －γ 基因的克隆及鑒定

用切膠回收試劑盒回收目的基因后與pMD18－T載體連接，轉化DH5α感受態細胞，涂布含有氨芐青霉素的平板，37℃過夜培養。挑取單菌落在LB液體培養液中培養，進行菌液PCR和酶切鑒定。

1.2.6 IFN－γ基因測序及序列分析

挑選陽性克隆送北京華大中生科技發展有限公司進行測序，測序結果采用DNAman等軟件進行序列分析。

2 結果

2.1 IFN－γ基因RT－PCR結果

RT－PCR擴增后，產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳，與DNA Marker DL 2000比較，目的條帶出582 bp與預期相吻合(見圖1)。

圖1 IFN－γ－PCR結果

2.2 IFN－γ－pMD－18T重組質粒結果鑒定

挑取LB瓊脂平板上的白色菌落，通過菌液PCR鑒定，菌液PCR結果見圖2，然后對鑒定為陽性的菌液提取質粒DNA，用EcoR I和Xho I進行雙

圖2 IFN－γ－pMD－18T重組質粒菌液PCR結果

2.3 IFN－γ基因序列分析

(1)測序后的多浪羊IFN－γ基因的核苷酸序列

圖3 IFN－γ－pMD－18T重組質粒雙酶切結果

測序結果全長為582bp(見圖4)，將測得的核酶切鑒定(圖3)，圖3結果出現兩條明顯條帶:2692 bp處為pMD－18T質粒、574 bp處為酶切后的目的基因。苷酸序列用Expasy tools分析，將核酸序列和氨基酸序列相對應(見圖4)。由圖5可以看出多浪羊IFN－γ的完整開放閱讀框的核苷酸序列長度為501bp，成熟蛋白編碼的氨基酸序列長度為166個氨基酸。

圖4 多浪羊IFN－γ基因全序列

(2)IFN－γ核苷酸多序列比對結果

通過比對發現擴增的目的片段在第391位一個相對保守的堿基處出現了一個突變，由A突變成了G，而在此位置上參比的序列都是A，可能A是高度保守的(圖5)。

圖5 IFN－γ核苷酸多序列比對

(3)IFN－γ氨基酸多序列比對結果

根據氨基酸多序列比對發現第131位由一個賴氨酸(AAA)變成了一個谷氨酸(GAA)(見圖6)。

圖6 IFN－γ氨基酸多序列比對

3 討論

隨著人們對干擾素研究的不斷深入，尤其是在分子生物學方面的研究，干擾素的分子結構、理化特性、生物學特性 、產生和作用 機理不斷得到闡明。在未來的臨床研究中，IFN將會推進我們對免疫調節過敏，哮喘，自身免疫性疾病，腫瘤的發展，器官移植，慢性感染機制的了解，可能會發現有效和有針對性的治療疾病的方法［4］。鑒于IFN－γ強大的生物學功能，其相關基礎和應用研究日漸增多，一些干擾素制品也逐漸出現和進入臨床應用［5］。由于體外細胞刺激時干擾素的表達量很低且難以純化，難以獲得足夠量的蛋白用于試驗研究和臨床應用，因而采用基因工程手段制備干擾素顯得尤為重要。

近年來，隨著對細胞因子研究的不斷深入和分子生物學技術的發展，在國內多種動物的IFN－γ基因［6－9］相繼被克隆，其相應的生物制劑在臨床上也得到了顯著的效果。

本研究應用RT－PCR技術成功克隆的多浪羊IFN－γ基因片段大小在582 bp左右。將測序結果進行分析得出多浪羊IFN－γ的核苷酸序列長度和氨基酸序列長度，通過NCBI BLASTp進行分析對多物種IFN－γ核苷酸和氨基酸多序列比對發現本實驗測得目的基因的核苷酸在391位發生了突變，導致氨基酸序列的第131位氨基酸由賴氨酸突變為谷氨酸。賴氨酸為堿性氨基酸而谷氨酸為酸性氨基酸，編碼的多肽鏈第131位的氨基酸由堿性氨基酸突變為酸性氨基酸，其氨基酸的性質變化較大，這可能是多浪羊適應新疆當地環境的一種選擇性突變，需要進行更進一步的研究是非常有必要的，對于研究動物的分子進化及其在動物分類上應用可能具有一定的意義。

［1］ 王春霞，王林川，黃愛芳，等.番鴨IFN－α基因的克隆與序列分析［J］.華南農業大學學報，2002，23(4):68－70.

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［3］ 賀艷艷，潘輝 ，劉書東等.新疆多浪羊淋巴細胞分離和培養［J］.塔里木大學學報，2010，22(4):11 －14.

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［6］ 王春霞，王林川，黃愛芳，等.番鴨IFN－α基因的克隆與序列分析［J］.華南農業大學學報，2002，23(4):68－70.

［7］ 海崗，韓宗璽，邵昱昊，等.共表達口蹄疫病毒vpl基因和山羊IFN－γ基因的重組山羊痘病毒的構建［J］.中國預防獸醫學報，2008，30(5):334－337.

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