新疆卡拉庫爾羊Fas基因的克隆及核苷酸序列分析

潘 輝 賀艷艷 李蓮瑞

Fas又稱APO－1，或者稱CD95分子，它屬于神經生長因子受體/腫瘤壞死因子受體超家族成員［1］，是一種細胞凋亡信號受體，因此亦被成為死亡分子。Fas誘導的細胞凋亡途徑又被稱為細胞凋亡的外部途徑，目前發現的死亡受體可以分為三大類，Fas是其中一種死亡受體的代表［2］。

細胞凋亡是指細胞程序化死亡，它與免疫有著重要的關系。有病毒能夠通過誘導T細胞自身發生凋亡，從而達到免疫抑制的目的［3］。目前已發現細胞凋亡與多種免疫缺陷病及細胞增生性疾病有關［4］，但是不同信號通路引起的細胞凋亡所引起的疾病亦有所不同，這也極大程度的激發了研究者對細胞凋亡致病機理研究的熱情。

Fas通過與其配體的結合以達到引起細胞凋亡的目的，可以說Fas是細胞凋亡的正控元件。FasL主要在活化的T淋巴細胞表面表達，Fas與之結合誘導細胞凋亡是T細胞殺傷靶細胞的主要途徑之一［5］。

中國卡拉庫爾羊屬于脂尾粗毛羊，其羔皮具有美麗的毛卷，在國際市場享有盛譽，具有良好的經濟價值。同時，卡拉庫爾羊耐嚴寒、酷暑和干旱的大陸性氣候，非常適合在新疆地區養殖［6］。近幾年，高密度集約化的養殖模式引起一些嚴重的卡拉庫爾羊傳染病相繼出現，對畜牧業提出了嚴峻的挑戰。

利用同源克隆技術，擴增出卡拉庫爾羊Fas基因，通過核苷酸分析和序列比對可以從分子水平來了解卡拉庫爾羊Fas的特異性變化，為研究者從分子免疫學角度研究卡拉庫爾羊抗病力提供了理論基礎。克隆卡拉庫爾羊Fas基因為制備相應的核酸探針打下基礎，Fas探針的制備能夠為卡拉庫爾羊某些疾病的診斷作出貢獻。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物、菌株、質粒

卡拉庫爾羊由塔里木大學動物科學學院試驗站提供;菌株E.coli DH5α本實驗室儲存、質粒pMD18－T購自上海生工生物工程技術有限公司。

1.1.2 試劑及酶

人淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品科技有限責任公司;Trizol購于invitrogen公司;Taq酶、T4 DNA連接酶、dNTP、逆轉錄試劑盒 PrimeScript Revere Transcriptase購自TaKaRa公司;限制性內切酶購自大連寶生物工程公司;DNA凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒均購自愛思進生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成

根據GeneBank中綿羊的Fas基因序列全長為976 bp(NM_001123003)設計卡拉庫爾羊Fas基因的一對引物PF、PR，由上海生工生物工程技術有限公司合成。為便于基因的克隆，在引物中引入了Eco R I和Xho I的酶切位點(以下劃線表示)。

1.2.2 卡拉庫爾羊淋巴細胞的提取

采集健康的卡拉庫爾羊血液10 mL，添加1 mL 3.8%枸櫞酸鈉溶液抗凝，然后將新鮮抗凝血11 mL.與Hank＇s液1:1稀釋混勻后，以2 mL/管的量分別置于玻璃離心管中，用移液槍吸取稀釋血液2 mL，沿管壁緩緩的疊加到1 mL人淋巴細胞分離液界面上，注意不要破壞分離液界面，以2000 r/min離心35 min后吸取淋巴細胞層［7］。

1.2.3 卡拉庫爾羊Fas基因的克隆

卡拉庫爾羊淋巴細胞總RNA提取按照Trizol試劑盒說明書進行。第一鏈cDNA的合成也按照PrimeScript Revere Transcriptase說明書進行。然后以合成的cDNA為模板進行PCR擴增。在20μL的PCR體系中:10×one step RT－PCR buffer 2μL，dNTP 1.6 μL，引物 PF、PR 各0.5 μL，模板 cDNA 1 μL，Taq 酶 0.4 μL，ddH2O 14 μL。PCR 程序設定:95℃預變性5 min，1個周期;94℃變性30 s;60.9℃ 退火30 s，72℃延伸1 min20 s，循環35個周期;最后72℃延伸10 min。取10μL PCR產物電泳檢測。用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產物中的目的片段(操作見試劑盒說明書)，參照克隆載體pMD18－T說明書，構重組質粒 pMD18－T－Fas。將此重組質粒轉化到大腸桿菌DH5α中，經藍白斑篩選和菌落PCR法初步鑒定后，再經過雙酶切鑒定，將可能的陽性克隆子送到上海生工生物工程技術有限公司測序，用DNA軟件分析測序結果。

2 結果

2.1 Fas基因擴增

從淋巴細胞中提取總RNA，進行RT－PCR擴

2.2 重組質粒的鑒定

為了驗證所得的陽性重組質粒，將提取的pMD18T－Fas重組質粒進行PCR及雙酶切鑒定。PCR結果出現大小約為994 bp片段(圖2)。由于在雙酶切時會切除保護性堿基形成黏性末端，結果pMD18T－Fas重組質粒經Eco R I和Xho I雙酶切后得到一個約為986 bp的片段(圖3)，上述獲得的片段大小均與預計相符。增，得到994 bp Fas目的基因(圖1)。

2.3 測序結果及分析比較

含有重組Fas基因的質粒經華大中生科技有限公司測序，證實本實驗中擴增的Fas基因為994 bp，含有一個750 bp的開放閱讀框，編碼了250個氨基酸，其中親水性氨基酸占36.8%，疏水性氨基酸占31.2%，堿性氨基酸占 18.4%，酸性氨基酸占13.6%，推斷的蛋白理論分子量為39.7 KDa。經過BLAST比對發現，擴增的Fas基因為半長基因，未包含信號肽序列。7－49位、51－87位均為胞外區富含半胱氨酸的結構亞域，它是Fas與Fas L相互作用的部位，95－117的18個氨基酸構成了氨基酸的跨膜區;胞質區則包含了一個由95個氨基酸構成的死亡結構域(圖4)。

圖4 擴增序列包含的一個大小為750 bp的開放閱讀框，對其結構域進行分析，它包含完整的Fas基因胞外區(TNFR)，跨膜區，和胞質區(死亡結構域)。

物種間Fas基因的比較分析，將卡拉庫爾羊的Fas基因與其它物種的相對應區域進行比對，發現卡拉庫爾羊Fas基因的核苷酸序列與參考序列NM_001123003同源性高達99.69%，與牛、豬、人的核苷酸序列同源性分別為 94.93%、75.52%、69.83%，其氨基酸同源性分別為 91.13%、69.11%、59.20%。

將各物種Fas的氨基酸序列比對后，構建系統進化樹(圖5)，由圖可以看出Fas蛋白與同是反芻類的羊和牛同源性最近，與嚙齒類動物的小鼠同源性較遠。

3 討論

3.1 經過BLAST比對發現，擴增的Fas基因為半長基因，未包含信號肽序列。7－49位、51－87位均為胞外區富含半胱氨酸的結構亞域，它是Fas與Fas L相互作用的部位，Fas及FasL是導致細胞凋亡的關鍵分子，是細胞免疫應答的重要介質，其涉及到自身免疫、驗證組織損傷等病理損傷［8］。95－117的18個氨基酸構成了氨基酸的跨膜區;胞質區則包含了一個由95個氨基酸構成的死亡結構域。Fas的死亡結構域在Fas與Fas結合后形成三聚體的活化形式，隨后引起與之結合的Fas相關死亡受體蛋白(FADD)的構想發生變化，從而啟動白介素1β轉化酶(ICE)的級聯反應，最終導致凋亡［9－10］。

3.2 將各物種Fas的氨基酸序列比對后，構建系統進化樹(圖5)，由圖可以看出Fas蛋白，同反芻類的羊和牛同源性最近，與嚙齒類動物的小鼠同源性較遠。

圖5 使用MEGA 4.0的Neighbor－joining算法構建進化樹

3.3 目前許多傳染病在影響著養羊業的健康發展，通過研究宿主細胞對外來病原微生物的反應機制，探討防治傳染病的新途徑，有助于提高養羊業的經濟效益［11］。因此，采用RT－PCR技術克隆了卡拉庫爾羊Fas基因，為進一步制備探針來檢測Fas基因在卡拉庫爾羊的細胞中的表達動態，對了解病毒與細胞凋亡的關系，為新的抗病毒策略提供思路。

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［3］ Hamel W Mangnelli L，Chiarugi VP，et al.Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase/Ganciclovir－mediated Apoptotic Death of Bystander Cells［J］.Cancer Res ，1996 ，56(12):2697 －2702.

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［5］ 郭梁，吳榮聰，王釗.與CD95相關的細胞凋亡和免疫調節［J］.生命的化學，2002，22(2):106－09.

［6］ 李蓮瑞，陳根元，王曉斌.新疆卡拉庫爾羊的研究現狀及前景［J］.中國草食動物，2008，28(2):63－64.

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