蒙藥升陽十一味丸對三種人消化系腫瘤細胞的增殖抑制作用

鄧秀玲 王 棟 劉淑萍

1.內蒙古醫學院生物化學與分子生物學教研室，內蒙古 呼和浩特 010059;2.內蒙古自治區醫院神經內科，內蒙古 呼和浩特 010017

惡性腫瘤嚴重威脅著人們的生命，人體的實體腫瘤60%都發生在消化道，我國更是消化道腫瘤高發國家，平均每小時就有120個中國人罹患消化道腫瘤。腫瘤的發生、發展與細胞異常增殖和分化有關，如何抑制腫瘤細胞的無限增殖能力，是腫瘤治療的一個基本問題 。本文研究蒙藥升陽十一味丸對體外培養的人三種消化系腫瘤細胞生長的影響，為尋找高效、低毒的抗癌新藥提供一些實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 培養基DMEM、1640為Gibco公司產品，胎牛血清為中國醫學科學院血液學研究所生產，噻唑藍(MTT)和二甲基亞砜 (DMSO)均為Sigama公司產品。蒙藥升陽十一味丸 (以下簡稱十一味丸)由內蒙古中蒙醫院制劑室生產，用PBS配成50mg/ml貯液，0.2mm濾膜過濾除菌4℃保存，實驗時用培養液稀釋到所需濃度。

1.2 細胞培養和實驗分組 MGC－803細胞由北京腫瘤研究所提供，于含慶大霉素80u/ml、10%滅活胎牛血清的DMEM的培養液中培養，結腸癌LoVo(購自天津腫瘤醫院)、胰腺癌細PC－3(購自中國醫學科學院細胞研究所)，于含10%胎牛血清的1640培養基中培養，置37℃、5%CO2溫箱中孵育，取對數生長期細胞用于實驗。實驗分為四組:陰性對照組 (只含腫瘤細胞，不加藥組)、陽性對照組 (紫杉醇處理組)、實驗組 (不同藥物濃度處理組)和空白對照組 (只含培養基，不含細胞和藥)。

1.3 十一味丸對三種癌細胞的增殖抑制作用 采用MTT法［1］。取對數生長期的三種細胞，經消化液消化后制成單細胞懸液，臺盤藍計數后，調整細胞數接種96孔板，胃癌MGC－803細胞以3×104個/ml、結腸癌LoVo細胞以2×104個/ml、胰腺癌PC－3細胞以5×104個/ml接種，每孔100ul，置37℃、5%CO2溫箱孵育24h。每孔再加含藥培養基100ul，結腸癌和胰腺癌設五個不同濃度處理組，至藥物終濃度分別為2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.63mg/ml、0.31mg/ml、0.15mg/ml。胃癌設6個不同濃度處理組分別為:2.5mg/ml、 2.0mg/m1、 0.25mg/ml、 0.63mg/ml、0.31mg/ml、0.15mg/ml。另設陰性對照組 (只有細胞，不加藥)和空白組 (只含等量培養基)，及紫杉醇陽性對照組，作用濃度為10－6mol/L，每組均為8個復孔。繼續培養72h，每孔加20ulMTT(5 mg/ml)，37℃孵育4h，1500r/min離心10min，棄上清，每孔加200ulDMSO，恒溫振蕩器振蕩10min，使結晶物溶解。選擇570nm波長，酶標儀上檢測各復孔吸光度 (A值)。進行數據統計時，每組去除一個最大值和最小值，按下列公式計算細胞生長抑制率。

抑制率 (%)=(對照組A值－實驗組A值)/(對照組A值－空白組A值)×100%

1.4 三種細胞的形態變化觀察 MGC－803細胞、LOVO、PC－3細胞經消化液消化后，臺盤藍計數以6×105個/ml接種75ml培養瓶中，培養24h，更換培養液，MGC－803對照組細胞用DMEM繼續培養，LOVO和PC－3細胞對照組用1640繼續培養;實驗組細胞加入含不同濃度十一味丸(2.5mg/ml、2.0mg/ml 、1.0mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml)的培養基，于培養后每6h觀察細胞形態變化并作照相記錄。

2 結果

2.1 十一味丸對三種癌細胞的增殖抑制作用 從表1、2、3可見，十一味丸可明顯的抑制胃癌MGC－803細胞、結腸癌LoVo和胰腺癌PC－3細胞的生長，實驗組吸光度與對照組比較有顯著性差異 (P＜0.05)，表現出很強的細胞毒作用。其 IC50分別為:1.57mg/ml、0.66mg/ml、0.91mg/ml。高濃度 (2.5mg/ml)對胰腺癌、胃癌細胞所表現的增殖抑制作用，與陽性對照組紫杉醇處理組相比不具有統計學意義 (P＞0.05)，表明該藥在體外對這兩種細胞的增殖抑制作用與紫杉醇相當。

表1 十一味丸對胃癌MGC－803細胞的增殖抑制作用

表2 十一味丸對結腸癌LoVo細胞的抑制作用

表3 十一味丸對胰腺癌細胞的增殖抑制作用

2.2 細胞形態學觀察 倒置光學顯微鏡下，胃癌MGC－803對照組細胞呈不規則多角形生長，細胞均質而透明 ，核大居中，核仁明顯，生長旺盛。2.5mg/ml十一味處理MGC－803細胞后形態較對照組發生了明顯改變。處理12h既有少數細胞開始變圓，細胞皺縮，24h后部分細胞已變圓，與周圍細胞脫離，體積變小，胞漿顆粒增多，細胞表面變得粗糙，出現“吐泡”現象，有些形似梅花狀改變，細胞數目減少。隨著作用時間的延長，貼壁細胞逐漸減少，呈“梅花狀”的細胞逐漸增多，為典型凋亡細胞的形態改變，有少量細胞脫落而懸浮于培養液中。正常培養的結腸癌LOVO細胞呈上皮樣貼壁生長，胞體較大;經該藥2.5mg/ml處理12h的LOVO細胞形態改變不明顯，細胞生長相對緩慢，至48h大部分細胞變圓，細胞周圍分泌物增加。胰腺癌PC－3細胞經該藥2.5mg/ml處理后細胞生長緩慢，胞質粗糙，細胞折光性下降。隨著作用時間的延長，細胞數目減少，不規則形狀的細胞增多，最后破碎壞死 。而對照組細胞呈類圓形貼壁生長，生長良好。

3 討論

蒙醫藥作為傳統民族醫學的一部分，具有顯著的民族和地域特色，理論獨特，蒙藥多用成藥且劑量小，具有高效、低毒發揮復合藥理作用、療效可靠等特點，已成為當今抗腫瘤藥物或免疫調節藥物等新藥開發的研究熱點之一［2］。

升陽十一味丸是由黃精、玉竹、天花粉、藜蒺等十一味單方組成的復方蒙藥，臨床上用于治療胃寒、消化不良、寒性腹瀉等癥。組方中有許多單方具有抗腫瘤的藥理作用［3，4，5］，但單方不能反映復方蒙藥的藥理作用及蒙醫學的理論體系，況且蒙醫學對消化系腫瘤又有自己獨特的認識與治療方法［6］。本實驗采用人們較為推崇的體外藥物敏感性實驗－MTT法，觀察十一味丸對胃癌、結腸癌、胰腺癌細胞增殖的影響。結果表明，該藥能顯著抑制體外培養的三種消化系腫瘤細胞的生長 (P＜0.05)，計算其IC50值分別為:1.57mg/ml、0.66mg/ml、0.91mg/ml，且抑制作用隨藥物濃度的增加而增強，表現出良好的量效關系。實驗中發現隨著作用時間的增加其抑制作用也在增強。經該藥作用后三種細胞最高抑制率＞50%，表明該藥對這三種細胞系均敏感。當藥物濃度＞0.63mg/ml，該藥可抑制胃癌、結腸癌、胰腺癌細胞的增殖或引起細胞死亡;當藥物濃度較低時，三種細胞生長抑制率＜30%，表明該濃度下對細胞的增殖抑制作用不理想。不同癌細胞接受同一種藥物作用的能力是有差別的，本實驗中，在同一濃度范圍內十一味丸對胃癌細胞、結腸癌細胞的增殖抑制作用較強，與紫杉醇的抑制作用相當 (P＞0.05)，最高抑制率達80%以上;而對胰腺癌的作用相對較弱。十一味丸抑制三種消化系腫瘤細胞增殖，表現出濃度、時間依賴性，這與某些中藥復方抗癌作用效果的報道相一致［7，8，9，10］。實驗中發現同一種藥物引起不同細胞增殖抑制的作用方式也有所不同，十一味丸作用于胃癌細胞后出現凋亡細胞的形態改變;而結腸癌、胰腺癌細胞經十一味丸處理后的形態改變趨向壞死。同時在本實驗中發現，低濃度 (＜1.25mg/ml)藥物處理后細胞生長緩慢，但早期形態改變不明顯。這一結果可為臨床應用蒙藥治療消化道腫瘤提供一定的理論參考價值。本文對該蒙藥抑制三種消化系腫瘤細胞的增殖只做了初步探討，具體的作用機制還需深入研究，從而為抗癌蒙藥進一步應用提供一些新思路。

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