復(fù)方蛹蟲草制劑對慢性疲勞綜合癥小鼠的治療作用

季錫中 寧 青 談 唯 張潤桐 賈曉斌

江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥新型給藥系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家中醫(yī)藥管理局中藥口服釋藥系統(tǒng)重點(diǎn)研究室，江蘇 南京 210028

慢性疲勞綜合征 (Chronic Fatigue Syndrome，CFS)是現(xiàn)代節(jié)奏緊張的生活方式下出現(xiàn)的一組以長期疲勞 (包括體力疲勞和腦力疲勞)為突出表現(xiàn)的全身性證候群，持續(xù)超過六個(gè)月，并伴有低熱、咽痛、頭痛、肌肉關(guān)節(jié)腫痛、抑郁、健忘、失眠或嗜睡等癥狀。活力降低，適應(yīng)能力減退，機(jī)體各系統(tǒng)的生理功能和代謝免疫功能低下。CFS病人的臨床癥狀主要有神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫三大系統(tǒng)的異常［1］，同時(shí)伴有認(rèn)知功能受損。蛹蟲草 (Cordyceps militaris(L.)Link)與冬蟲夏草同屬異種，系我國名貴傳統(tǒng)滋補(bǔ)強(qiáng)身藥材，人工培養(yǎng)較成功，有較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。蛹蟲草中的多糖類大極性分子是其提高機(jī)體免疫功能的有效組分［2，3］，具有抗感染、抗氧化以及免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)活性，提示多糖成分可能對CFS有效。本課題以poly I:C模擬病毒感染，建立小鼠CFS模型，在整體水平研究蛹蟲草復(fù)方對CFS模型小鼠的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及材料

昆明種健康雄性小鼠，體重 (20±2)g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，許可證號SCXX(滬)2007－0005。血清皮質(zhì)酮放免試劑盒 (北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司);聚肌胞 (polyriboinosinic polyribocytidylic acid，poly I:C，美國Sigma公司)主要儀器:酶標(biāo)儀 (美國Thermo Electron公司);小鼠跳臺儀 (STT－2，醫(yī)科院研制所);

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組及給藥

小鼠隨機(jī)分成5組，分別為蛹蟲草復(fù)方低、中、高劑量組0.6、1.1、3.4g生藥/kg體重，空白對照組和模型組。模型組和給藥組小鼠腹腔注射poly I:C(5mg/kg)造成慢性疲勞綜合征模型，正常組每天給予生理鹽水，共16天。復(fù)方蛹蟲草制劑由蛹蟲草、熟地黃、枸杞子、黨參、大棗組成，均購自亳州市聯(lián)華醫(yī)藥有限公司。將處方量藥材投料，水煎煮2次，每次1.5小時(shí)，過濾，合并濾液，濃縮得浸膏，加水混勻后灌胃給藥。

1.2.2 力竭游泳實(shí)驗(yàn)

采用Thomas［4］等建立的方法并改進(jìn)。末次給予受試物30 min后，置小鼠于游泳箱中，水深30 cm，水溫 (23±1)℃，小鼠尾根部負(fù)荷5%體重的鉛皮，記錄小鼠游泳開始至死亡的時(shí)間作為小鼠游泳時(shí)間。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行6次，分別為造模后6 h，以及造模后第4、7、10、13、16天。

1.2.3 開野實(shí)驗(yàn)

正方形開野實(shí)驗(yàn)箱為80 cm×80 cm×75 cm，底板為10 cm×10 cm的方格，其正上方距離底板90 cm高處放一60 W白熾燈泡。測試時(shí)將小鼠放于開野箱中央，觀察10 min內(nèi)小鼠的自主活動情況行走路線與格子交叉點(diǎn)數(shù)［5］。

1.2.4 跳臺實(shí)驗(yàn)

末次給藥30 min后，將小鼠置于跳臺儀中，適應(yīng)環(huán)境3 min，然后底部銅柵通以36 V交流電，小鼠學(xué)習(xí)跳上跳臺躲避電擊。24 h后檢測小鼠的記憶情況，記錄其5 min內(nèi)跳下平臺的次數(shù) (錯誤次數(shù))，以此作為學(xué)習(xí)成績。

1.2.5 血清皮質(zhì)酮含量測定

小鼠于造模后第16天摘眼球取血，每只小鼠取外周血0.2 mL，3000 r/min 4°C離心10 min。按照放免試劑盒說明書操作方法測定血清皮質(zhì)酮含量。

1.2.6 臟器指數(shù)的測定

造模后第16天，小鼠處死后取出胸腺、脾臟，用電子天平稱取其濕重，然后根據(jù)體重計(jì)算胸腺、脾臟指數(shù)。

1.2.7 Con A誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖

將小鼠斷頸處死后，取脾臟并制成細(xì)胞懸液。以RPMI－1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106個(gè)/mL。在Con A(5μg/mL) 作用下置37°C、5%CO2條件下培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束后，離心，棄上清，每孔加入二甲基亞砜200μL，室溫震蕩，在酶標(biāo)儀上570 nm處檢測OD值。

1.2.8 CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)小鼠于造模后第16天摘眼球取血，用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，加入熒光標(biāo)記抗CD4和CD8抗體，4℃避光反應(yīng)30 min，30 min后用PBS洗滌2次，用400 μL 1%多聚甲醛固定，流式細(xì)胞儀檢測CD4+、CD8+細(xì)胞數(shù)。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0進(jìn)行方差分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 蛹蟲草復(fù)方對慢性疲勞小鼠力竭游泳時(shí)間，自發(fā)活動，學(xué)習(xí)能力和血清皮質(zhì)酮水平的影響力竭游泳實(shí)驗(yàn)反映小鼠疲勞情況。由表1可見，和模型組相比，高劑量組能夠顯著延長疲勞小鼠的游泳時(shí)間 (P＜0.05)。開野實(shí)驗(yàn)是測定小鼠在一定區(qū)域一定時(shí)間內(nèi)的活動數(shù)，反映了其自發(fā)活動，其活動數(shù)目增多或減少能夠表示中樞神經(jīng)系統(tǒng)的“興奮”或“抑制”。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中劑量組和高劑量組均能夠顯著提高小鼠自發(fā)活動 (P＜0.05)。跳臺實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚍从承∈蟮膶W(xué)習(xí)能力，模型組錯誤次數(shù)顯著高于正常組，高劑量可以改善小鼠的學(xué)習(xí)能力，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。血清皮質(zhì)酮含量反應(yīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能，模型組小鼠血清皮質(zhì)酮水平顯著低于正常組，CCM能夠劑量依賴性地提高皮質(zhì)酮含量，高劑量組具有顯著地改善作用 (P＜0.05)。

表1 復(fù)方蛹蟲草制劑對慢性疲勞綜合癥小鼠力竭游泳時(shí)間、自發(fā)活動、學(xué)習(xí)能力、血清皮質(zhì)酮的影響

2.2 蛹蟲草復(fù)方對慢性疲勞小鼠臟器指數(shù)和淋巴細(xì)胞增殖的影響

胸腺和脾臟指數(shù)能夠反映免疫情況。如表2所示，蛹蟲草復(fù)方對模型組造成的胸腺增大沒有拮抗作用，而對脾臟增大有抑制作用，和模型組相比，高劑量組抑制率可達(dá)59.23%(P＜0.05)。末次給藥后取小鼠脾臟，體外用Con A刺激，模型組小鼠T淋巴細(xì)胞的增值能力顯著下降，CCM能夠劑量依賴性地提高其增殖能力，高劑量組幾乎恢復(fù)到正常水平 (P＜0.05)。

表2 復(fù)方蛹蟲草制劑對慢性疲勞綜合癥小鼠臟器指數(shù)、淋轉(zhuǎn)刺激指數(shù)的影響

2.3 蛹蟲草復(fù)方對外周血中CD4+T和CD8+T細(xì)胞的影響

造模后第16天，用流式細(xì)胞儀測定小鼠外周血中CD4+T和CD8+T細(xì)胞的表達(dá)情況。poly I:C能夠通過增加CD4+T細(xì)胞數(shù)目以及減少CD8+T細(xì)胞數(shù)目從而提高CD4+T/CD8+T比值，蛹蟲草復(fù)方能夠改善兩種細(xì)胞數(shù)目的異常，使其接近于正常水平。

表3 復(fù)方蛹蟲草制劑對慢性疲勞綜合癥小鼠T細(xì)胞亞群的影響

3 討論

慢性疲勞綜合癥的一個(gè)主要癥狀就是神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)紊亂，臨床上也用免疫增強(qiáng)劑治療該病［6］。CFS病人常伴隨與病毒感染相同的癥狀并且在有些病人體內(nèi)能夠檢測到一些病毒的存在，而這種潛在的病毒引起的感染可能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)－內(nèi)分泌－免疫系統(tǒng)之間的相互作用導(dǎo)致CFS的發(fā)生。

CFS病人細(xì)胞免疫功能的改變表現(xiàn)為T效應(yīng)細(xì)胞功能、淋巴細(xì)胞增殖功能、單核細(xì)胞吞噬抗原能力下降及T細(xì)胞亞群數(shù)目與比值的改變。上述細(xì)胞免疫功能的下降，可導(dǎo)致機(jī)體的清除能力和應(yīng)答外來抗原的能力下降，從而使病毒可長期潛伏體內(nèi)或外來抗原不能被清除。本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射poly I:C復(fù)制一種小鼠慢性疲勞模型，從整體上評價(jià)神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫和行為的異常癥狀，CCM具有明顯的改善作用，可能對防治人類的慢性疲勞綜合癥具有潛在的價(jià)值。藥物對poly I:C激活的胸腺功能沒有作用，而是通過抑制脾的激活發(fā)揮作用，其具體作用機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

［1］Komaroff A L.The biology of chronic fatigue syndrome［J］.Am J Med，2000，108(2):169－171.

［2］陳順志.冬蟲夏草和北蟲草研究進(jìn)展［J］.中國生化藥物，1995，16(5):242－245.

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［4］Dietert R R，Dietert J M.Possible role for early－life immune insult including developmental immunotoxicity in chronic fatigue syndrome(CFS)or myalgicencephalomyelitis(ME) ［J］.Toxicology，2008，247(1):61－72.

［5］Barker E，F(xiàn)ujimura S F，F(xiàn)adem M B，et al.Immunologic abnormalities associated with chronic fatigue syndrome［J］.Clin Infect Dis，1994，18:S136－141.［6］Cleare A J.The HPA axis and the genesis of chronic fatigue syndrome［J］.Trends Endocrinol Metab，2004，15(2):55－59.