大鼠皮層小膠質細胞氧糖剝奪模型的制備

李昕華

(長春市中心醫院神經內科 長春 130000)

短暫的輕度缺血即可導致中樞神經系統損傷,小膠質細胞是中樞神經系統內免疫感受和效應細胞[1],對保護腦組織有重要作用。本實驗采用體外氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation,OGD)模型來模擬腦損傷過程,為研究缺血過程中小膠質細胞的腦保護作用提供了可靠、實用的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

出生1～2d Wistar大鼠。購自吉林大學中心實驗室。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠皮層小膠質細胞原代培養和鑒定 采用酶消化法結合機械分離法進行培養[2]。應用倒置顯微鏡觀察不同時期細胞形態及生長情況。在培養第8天用OX42免疫細胞化學染色進行鑒定。

1.2.2 制備小膠質細胞OGD模型及評價 (1)缺氧DHank’s液的制備及缺氧罐的制作。方法同前期研究[3]。(2)小膠質細胞OGD模型的建立及LDH漏出率測定。用缺氧D-Hank’s液洗滌并孵育培養至第8天的小膠質細胞,在缺氧罐中37℃培養;取缺氧時間為30、60、120、180min再復氧24h的細胞檢測LDH漏出率,方法按說明書進行。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 小膠質細胞原代培養及鑒定

小膠質細胞在培養第8天分化成熟,OX42陽性細胞百分比為(97.33±2.15)%。

2.2 小膠質細胞OGD模型制備及評價

血氣分析儀測量缺氧D-Hank’s液氧濃度＜1%,抽成真空及通入缺氧氣體后缺氧罐內氧含量為(1±0.1)%,二氧化碳濃度為(5±0.1)%。小膠質細胞LDH漏出率隨缺氧時間延長逐漸增加,OGD60min之后與30min比較LDH漏出率有統計學差異,見表1。

表1 LDH漏出率[（n=48，%）,(±s)]

表1 LDH漏出率[（n=48，%）,(±s)]

注：▲P<0.05 小膠質細胞15min;#P<0.05 小膠質細胞45min

0min 30min 60min 120min 180min小膠質細胞 0.95±0.05 (4.81±0.39)▲ (17.08±1.08)# (29.04±1.96)# (36.38±1.76)#

3 討論

采用OX42免疫細胞化學染色后,小膠質細胞在倒置顯微鏡下呈細長或橢圓形,從胞體發出細長而有分支的突起,表面有許多小棘突,97%以上細胞為OX42陽性。本實驗可在培養第8天可分離出高純度的成熟小膠質細胞。

目前有多種腦缺血模型制備方法及操作手段[4],本實驗用自行設計生產的缺氧系統培育成熟的小膠質細胞,建立OGD模型,隨OGD時間增加,小膠質細胞損傷逐漸增加,OGD60min后損傷明顯。實驗結果說明本實驗采用的OGD方法可明顯造成小膠質細胞缺血、缺氧性傷害,可成功模擬中樞神經系統小膠質細胞缺血性損傷。

[1]Bayer AU,Keller ON,Ferrari F,et al.Association of glaucoma with neurodegenerative diseases with apoptotic cell death,Alzheimer's disease and Parkinson's disease[J].Am J Ophthalmol,2002,133,1:135～137.

[2]Simon Moussauda,b,Henning Joerg Draheimb.A new method to isolate microglia from adult mice and culture them for an extended period of time[J].Journal of Neuroscience Methods,2010,187:243～253.

[3]莽靖,李昕華,閻世軍,等.大鼠皮層神經元原代培養、鑒定及氧糖剝奪模型的建立[J].中國老年學雜志,2010,6:790～791.

[4]Zhang J,Qian H,Zhao P,et al.Rapid hypoxia preconditioning protects cortical neurons from glutamate toxicity through delta-opioid recepto[J].Stroke,2006,37:1094～1099.