建立新西蘭白兔深靜脈血栓模型的實驗研究

鄭玉江，湯慶，鄧方閣，張浩

深靜脈血栓形成(deep venous thrombosis,DVT)多見于下肢，嚴重危害人類的生命與健康。DVT的動物模型是研究體內靜脈血栓形成發病機制和評價相應治療方法的重要工具。DVT形成的三要素為血流緩慢、血管壁損傷、血液高凝狀態[1]。本實驗采用同時滿足上述條件來激活凝血系統，形成穩定血栓，構建兔DVT模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 普通級健康新西蘭大白兔8只，雌雄不限，體重約2.0～2.5 kg，由中山大學實驗動物中心提供(合格證號：0070409)。實驗前正常飼養1周。采用自身對照研究，任意選擇一側股靜脈為實驗組，對側股靜脈為對照組。

1.2 模型制備 3%戊巴比妥鈉1 ml∕kg兔耳緣靜脈注射麻醉，密切觀察其心率和呼吸變化。將兔仰臥位固定，雙側后肢內側區備皮、消毒。沿右(或左)下肢近端沿股靜脈的走向，做長約4 cm的斜形皮膚切口，分離皮下及肌肉組織，可見股動脈、股靜脈及股神經相伴行。小心分離股靜脈，避免撕裂管壁。游離股靜脈約2 cm，血管夾夾閉近心端，以無齒鑷鉗夾遠端血管壁10次，在血管夾遠心端約1 cm處用1 ml注射器平行向心插入股靜脈，注入0.1 ml凝血酶(終濃度150 U∕ml，湖南一格制藥有限公司生產)，迅速退出針頭，按壓針孔處數分鐘。血管夾保留2 h，期間不定時向組織滴加生理鹽水以保持濕潤。2 h后緩慢取出血管夾，分層縫合肌肉與皮膚。對照側肢體不做處理。肌注硫酸慶大霉素40000 U(湖北天藥藥業股份有限公司)。術畢，手術側肢體加小夾板行石膏繃帶固定于屈髖屈膝位，放回兔籠繼續飼養48 h。模型制備后每天觀察實驗兔的一般狀態并記錄。

1.3 彩色多普勒超聲檢測 SEQUOIA-512型彩色多普勒超聲診斷儀(德國西門子公司，實時凸陣探頭，頻率10 MHz，可自動計算流速)對兔的雙側股靜脈進行二維、彩色多普勒(CDFI)及頻譜多普勒(PW)超聲掃查，觀察血栓形成及靜脈血流情況。

1.4 病理學檢查 模型制備后48 h，靜脈注入過量戊巴比妥鈉溶液處死動物。取血栓形成節段及對側正常節段股靜脈血管置于10%中性福爾馬林溶液中固定，48 h后石蠟包埋，橫切血管段制成病理切片，經蘇木精-伊紅染色，置顯微鏡下觀察血栓形成情況。

2 結果

圖1 DVT模型彩色多普勒超聲檢測

2.1 一般狀態 8只兔均存活，未出現靜脈血管損傷破裂出血等嚴重并發癥以及呼吸困難、氣促、嗆咳、休克等肺動脈栓塞癥狀，精神尚可，下肢活動受限。其中3只兔手術側肢體明顯腫脹伴發熱。

2.2 超聲檢測 見雙側股靜脈管腔均表現為無回聲。探頭加壓，實驗側股靜脈不能被壓癟，對照側可壓癟。CDFI及PW示實驗側靜脈管腔內無彩色血流及血流頻譜信號，對照側可見充盈管腔的彩色血流信號及隨呼吸變化的血流頻譜(圖1)。

2.3 病理學檢查 8只動物均成功建立股靜脈血栓模型，4只位于左側，4只位于右側。血栓段股靜脈肉眼下見血栓充滿靜脈管腔，呈紫紅色，與管壁無粘連。光鏡下可見血管內皮細胞不完整以及均質粉染的血栓，血栓主要為均勻分布的紅細胞，其間可見纖維素網狀結構及散在血小板及白細胞。對照側股靜脈血管內膜表面光滑、平整，未見血栓形成(圖2)。

圖2 DVT模型的病理檢測

3 討論

DVT是臨床常見疾病，發病率在國內外均呈逐年增多趨勢，具有很高的致殘率及致死率[2-3]。目前關于DVT形成的危險因素也不斷補充和完善，如年齡、肥胖、靜脈曲張、吸煙、髂動脈壓迫綜合征等[4]；這些危險因素可相互疊加、相互影響[5]，最終導致血流滯緩，血管內皮缺氧、受損，血液高凝，從而促使DVT的發生。

在本實驗中，我們選擇新西蘭白兔進行DVT模型制備，因為與鼠等小型動物相比，兔的股靜脈壓力較高，血流量較充足，且血栓形成迅速，并可充盈整個血管腔，易于觀測；同時新西蘭白兔比起犬、豬等大型動物，其價格經濟，性情溫順，易于超聲檢查。

目前，單純靜脈結扎是制備血栓模型的確切方法，但較為耗時[6]。本實驗采用注入凝血酶以加快血栓形成。當血管夾在近端阻滯股靜脈后，在股靜脈遠端注入凝血酶。由于凝血酶注入后可使靜脈管腔張力增加，管壁由原來的淡粉色變成半透明色，當注射針孔經過短暫幾分鐘的壓迫后即可止血，并迅速形成肉眼可見的血栓。在血栓形成后0.5 h，暗紅色的血栓逐漸向近心端蔓延，表明本實驗制備DVT模型時在近端阻滯靜脈，遠端注入凝血酶的方法可行，不僅可形成確切的血栓，還有效地提高建模的成功率。這與文獻報道相一致[6]。

術后48 h實驗側股靜脈病理結果示管腔內血栓充盈，血管內皮細胞不完整，炎性細胞浸潤，血栓與管腔無粘連，這與文獻報道基本一致，同時也符合人體DVT急性期病理表現[7-8]。由于這個時候血栓尚未與血管壁發生機化、粘連，采用溶栓療法和取栓術均能取得滿意的效果[9]。

本實驗術后的肢體制動也很重要。因為形成初期的靜脈血栓與管壁粘連不緊，質地松脆，活動或按壓肢體易使血栓脫落導致肺栓塞。新西蘭白兔雖然是較溫順的動物，但喜咬嚙，單純的石膏繃帶達不到固定的目的，故我們采用小夾板與石膏繃帶共同固定的方法。

[1]Torbicki A,Perrier A,Konstantinides S,et al.Guidelines on the diagnosis and management of acute pulmonary embolism:the Task Force for the Diagnosis and Management of Acute Pulmonary Embolism of the European Society of Cardiology(ESC)[J].Eur Heart J,2008,29(18):2276-2315.

[2]Abad Rico JI,Llau Pitarch JV,Rocha E.Overview of venous thromboembolism[J].Drugs,2010,70(S2):3-10.

[3]Wojcik BM,Wrobleski SK,Hawley AE,et al.Interleukin-6:A potential target for post-thrombotic syndrome[J].Ann Vasc Surg,2010,[Epub ahead of print].PMID:21131172.

[4]Cushman M.Epidemiology and risk factors for venous thrombosis[J].Semin Hematol,2007,44(2):62-69.

[5]Martinez-Zubieta R.Venous thromboembolism risk and prophylaxis in the acute hospital care setting(ENDORSE II study):results of a Mexican national cross-sectional study[J].Cir Cir，2010,78(4):333-341.

[6]Roy S,Laerum F,Brosstad F,et al.Animal model of acute deep vein thrombosis[J].Cardiovasc Intervent Radiol,1998,21(4):329-333.

[7]張惠明,張力.簡易懸吊術制備大鼠深靜脈血栓模型[J].現代中西醫結合雜志,2009,18(17):1979-1980.

[8]陸慰萱,劉春萍.深靜脈血栓形成和肺血栓栓塞癥的自然病程[J].中華醫學雜志,2003,83(1):84-86.

[9]孟申,王方永.地震創傷后下肢深靜脈血栓形成與肺栓塞防治[J].中國康復理論與實踐,2008,14(7):662-664.