肥胖大鼠心肌細胞內游離鈣濃度的變化

郝艷坤，何志鵬，魏韜

肥胖是心血管病的重要危險因素[1]，肥胖與心腦血管病的關系已倍受臨床重視。本研究選用合成的高脂飼料，成功地建立了肥胖不同易感性動物模型[2]。采用激光掃描共聚焦顯微技術檢測胞內Ca2+的變化情況。

1 材料與方法

1.1 肥胖易感性動物模型的建立 健康成年雄性SD大鼠60只，體質量180～200 g，由哈爾濱醫科大學實驗動物中心提供。大鼠給予高脂飼料喂飼2周后，根據體質量增加量排序，選出位于中間的1/4鼠(15只)為基礎對照組(基礎組)，繼續給予基礎飼料，其余大鼠繼續喂飼高脂飼料。在第8周時，再次按照體質量增加量排序，上1/3鼠(15只)為肥胖組，下1/3鼠(15只)為抵抗組，中間1/3鼠(15只)剔除。實驗飼料參考了美國分析化學學會(AOAC)配方和美國營養學會(AIN)實驗大鼠合成飼料配方[3]。

1.2 血清及體脂肪含量的測定 大鼠用水合氯醛35 mg/kg麻醉后，打開腹腔，自腹主動脈迅速采血2 ml，靜置30 min，1000 r/min離心20 min，－80℃保存待用。用血清學試劑盒和血清自動生化分析儀測量血脂濃度指標。留取睪周脂肪組織、腎周脂肪組織和網膜脂肪組織，計算體脂肪含量。

體脂肪含量(%)=(睪周脂肪+腎周脂肪+網膜脂肪)/體質量×100%

1.3 心肌細胞的分離與Fluo-3/AM負載 水合氯醛溶液麻醉后，迅速開胸取出心臟，置于正常臺氏液中，修剪組織后，主動脈逆行插管連在Langendorff離體灌流裝置上。先用正常臺氏液連續灌流5 min，然后用無鈣臺氏液繼續灌流至心臟停搏，最后用濃度為0.02%膠原酶Ⅱ(8 mg/50 ml)和牛血清白蛋白(8 mg/50 ml)的無鈣臺氏液灌流分離心肌細胞。取分離穩定好的細胞，800 r/min離心3 min，去除上清液。分別用1/8、1/4、1/2、1倍有鈣液進行梯度覆蓋，每個10 min。用5 μmol/L Fluo-3/AM避光，37℃溫箱染色40 min。1000 r/min離心1 min，去除負載液，用正常臺式液沖洗2次，再用正常臺式液將細胞稀釋到所需濃度待用。

1.4 大鼠心肌細胞胞漿Ca2+濃度([Ca2+]i)測定 取分離后的細胞置于自制浴槽中，共聚焦激光掃描顯微鏡下選取桿狀、橫紋清晰無顆粒的細胞開始實驗。在Time series模式下對XY平面的細胞掃描，每10 s采集一次數據，連續采集30次。基礎熒光值按最小噪聲最大圖像信號人為設定。預掃描獲得基礎值后，于第2次和第3次掃描之間，在有鈣液中加入終濃度為30 mmol/L KCl，在無鈣液中加入10 mmol/L咖啡因進行掃描。平均熒光強度以給藥后與給藥前的熒光強度比值(FI∶FIo)表示[4-5]。

1.5 統計學方法 實驗數據以()表示，組間比較采用SPSS 13.0軟件進行方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 體質量 至第12周時，基礎組、肥胖組和抵抗組大鼠體質量分別為(520.57±49.87)g、(553.43±46.21)g、(507.00±40.59)g，肥胖組較抵抗組質量大(P＜0.05)；基礎組、肥胖組和抵抗組體質量增量分別為(312.01±12.24)g、(350.29±12.57)g、(266.77±11.81)g，肥胖組與基礎組、肥胖組與抵抗組比較均有顯著性差異(P＜0.05)。

2.2 體脂肪 肥胖組大鼠睪周脂肪、腎周脂肪、網膜脂肪和體脂比與基礎組和抵抗組大鼠比較均有增高(P＜0.05)。見表1。

2.3 血脂 肥胖組大鼠血漿血清總膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白的濃度均高于基礎組和抵抗組大鼠(P＜0.05)；肥胖組大鼠血漿高密度脂蛋白與基礎組和抵抗組大鼠比較無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體脂及血脂水平比較(n=15)

2.4 KCl誘導[Ca2+]i的變化 基礎組、肥胖組與抵抗組大鼠心肌細胞[Ca2+]i平均熒光強度分別升高(6.33±0.56)、(4.74±0.29)和(9.14±0.57)倍，肥胖組較基礎組及抵抗組降低(P＜0.05)。

2.5 咖啡因誘導[Ca2+]i的變化 基礎組、肥胖組與抵抗組大鼠心肌細胞[Ca2+]i平均熒光強度分別升高(3.54±0.27)、(2.67±0.24)和(4.62±0.28)倍，肥胖組較基礎組及抵抗組降低(P＜0.05)。

3 討論

本實驗通過高脂飲食篩選出肥胖易感性不同的大鼠，測定發現，在體質量增量、各部位脂肪濕重、體脂肪含量、三酰甘油等指標方面，肥胖組較基礎組升；抵抗組動物的各項指標與基礎組相近。提示飲食篩選出的肥胖與肥胖抵抗動物模型較為理想。

已有研究提示，肥胖者體內大量脂肪積聚，促進瘦素合成分泌，可導致鈣離子通道、鈉鈣交換體等調控細胞內鈣平衡的蛋白質功能紊亂。實驗證明，肥胖大鼠心律失常的發生率顯著高于正常大鼠[6]。導致肥胖大鼠心律失常易感性增高的因素可能是多方面的，如各種離子通道重構和失衡等都可以導致心肌細胞膜穩定性異常[7]。其中，Ca2+由于其第二信使的功能和介導興奮-收縮耦聯的作用，成為影響心肌電生理和收縮功能的核心離子。細胞內外Ca2+濃度的變化和失衡是形成觸發活動，引發早后除極、遲后除極，誘導多種心律失常發生的根本機制。

我們應用共聚焦技術發現，肥胖組大鼠心肌細胞內鈣在KCl除極后[Ca2+]i平均熒光強度明顯低于基礎對照組和肥胖抵抗組大鼠，提示肥胖可使大鼠心室肌內Ca2+濃度發生改變，可能是造成肥胖易發生心律失常的因素之一。

心肌細胞內Ca2+的平衡由內鈣釋放和外鈣內流共同調節[7]。本實驗在無鈣環境采用咖啡因誘導鈣瞬變，與基礎對照組和肥胖抵抗大鼠相比，肥胖組大鼠心肌細胞鈣瞬變幅度下降，提示肌漿網鈣釋放量和速率下降可能是由內鈣釋放降低造成的。

綜上所述，肥胖心肌細胞內鈣發生顯著改變，導致心肌細胞內離子的平衡被打破，可能是肥胖心律失常的機制之一。該研究對今后開發預防治療肥胖對心血管系統影響具有理論指導意義。

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