RELN基因單核甘酸多態(tài)性與兒童孤獨癥臨床特征的相關(guān)分析

孫穎，盛昭明，劉明遠，楊利敏，李興洲，姜志梅

兒童孤獨癥是一種較為嚴重的發(fā)育障礙性疾病，多于3歲前發(fā)病，男孩比女孩多見。它的基本特征是不同程度的言語發(fā)育障礙、人際交往障礙、興趣狹窄和行為方式刻板。孤獨癥的病因涉及環(huán)境和遺傳因素，家系研究和雙生子研究證實遺傳因素在孤獨癥發(fā)病中起關(guān)鍵的作用。

RELN基因定位在孤獨癥的易感基因座位7q22，編碼的reelin蛋白在與腦發(fā)育相關(guān)的神經(jīng)元遷移和定位過程發(fā)揮重要作用。國外已進行許多該基因與孤獨癥的關(guān)聯(lián)研究，但有關(guān)研究得出的結(jié)論不一。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2006年1月～2007年12月佳木斯大學附屬第三醫(yī)院發(fā)育與行為兒科收治孤獨癥患兒30例，均為漢族，其中男性24例，女性6例；年齡3～12歲。同期選取佳木斯幼兒園和小學的健康兒童30例為對照組，其中男性24例，女性6例；年齡3～12歲。兩組兒童性別及年齡無顯著性差異(P＞0.05)。

1.2 診斷標準 所有患兒符合美國《精神障礙診斷和統(tǒng)計手冊》第4版(DSM-Ⅳ)規(guī)定的兒童孤獨癥的診斷標準[2]。

1.3 納入標準

1.3.1 病例組 ①年齡3～12歲漢族兒童；②完全符合兒童孤獨癥的診斷標準；③孤獨癥兒童行為檢查量表(Autism Behavior Checklist，ABC)評分≥67分；兒童孤獨癥評定量表(CARS)評分≥30分；④家長知情同意。

1.3.2 對照組 ①年齡3～12歲，與相應(yīng)匹配的病例組兒童的年齡相差不超過0.5歲；②與病例組相應(yīng)匹配兒童的性別相同；③漢族；④孕期及出生時正常；⑤與病例組兒童無血緣關(guān)系；⑥家長知情同意。

1.4 排除標準 全面體格檢查和神經(jīng)精神檢查后認為該名兒童可能存在已知病因的發(fā)育障礙或其他神經(jīng)精神疾病，包括精神發(fā)育遲滯、其他廣泛性發(fā)育障礙。

1.5 檢測方法 每名研究對象抽取靜脈血2 ml置于EDTA抗凝管內(nèi)，搖勻后立即－20℃凍存。使用DNA提取試劑盒提取DNA。

RELN基因exon 6 SNP的基因分型采用聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)。PCR引物如下：

正向5′-ACA GCA TGT TGG CAC TTG TG-3′反向5′-TTG GTG GTA GGA GTC AAA GT-3′

用大連寶生物公司的TaKaRa TaqTM試劑盒擴增。PCR反應(yīng)液共25 μl，內(nèi)含基因組DNA、引物、Taq酶、緩沖液、dNTPs。PCR條件：95℃預變性10 min，繼以94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)，72℃終末延伸8 min。經(jīng)PCR儀擴增后產(chǎn)物為135 bp，由內(nèi)切酶PvuⅡ酶切后產(chǎn)生79 bp和56 bp兩個片斷，組成3種基因型：A/A（135 bp/135 bp），A/G（135 bp/79 bp/56 bp），G/G（79 bp/56 bp）。

1.6 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用統(tǒng)計分析軟件SPSS 11.5計算不同基因型在不同組間的分布情況。

2 結(jié)果

2.1 RELN基因exon 6 SNP基因型分布 A等位基因PCR產(chǎn)物不含PvuⅡ酶切位點，只有一個長度為135 bp的片段。G等位基因PCR產(chǎn)物含PvuⅡ酶切位點，酶切后產(chǎn)生長度分別為79 bp和56 bp的片段。根據(jù)電泳結(jié)果，exon 6 SNP A/A基因型為一條長135 bp的條帶，A/G基因型為3條長度為135 bp、79 bp和56 bp的條帶，G/G基因型為兩條長79 bp和56 bp的條帶（圖1）。

2.2 基因型和等位基因頻率 χ2檢驗顯示基因型及等位基因頻率分布符合H-W平衡法則。兒童孤獨癥組與對照組exon 6 SNP基因型和等位基因頻率存在顯著性差異(P＜0.05)。見表1。

圖1 exon 6 SNP基因型分型電泳圖

表1 兩組exon6 SNP基因型與等位基因頻率

2.3 基因型與臨床特征的關(guān)系 單因素方差分析顯示，不同基因型孤獨癥兒童ABC總分及交往因子得分存在非常顯著性差異（P＜0.01)；經(jīng)進一步LSD分析，在基因型為A/A和A/G、A/A和G/G孤獨癥兒童之間，交往因子存在顯著性差異(P＜0.05)，基因型為A/G和G/G之間ABC總分存在顯著性差異(P＜0.05)。見表2。

2.4 病情嚴重程度與exon 6 SNP的關(guān)系 重度與輕中度孤獨癥組exon 6 SNP基因型及等位基因分布存在顯著性差異(P＜0.05)。見表3。

2.5 不同基因型兒童CARS得分的比較 單因素方差分析顯示，不同基因型的孤獨癥兒童模仿、聽覺反應(yīng)、非語言和總分存在顯著性差異(P＜0.05)；LSD分析，在基因型為A/A、G/G的孤獨癥兒童之間在模仿、聽覺反應(yīng)和CARS總分存在顯著性差異(P＜0.05)；在基因型為A/A和A/G、A/A和G/G的孤獨癥兒童之間，非語言存在顯著性差異(P＜0.01)。見表4。

表2 exon 6 SNP不同基因型ABC得分的比較(n=30)

表3 孤獨癥組CARS評分重度組與輕中度組exon 6 SNP比較

表4 不同基因型CARS評分比較

3 討論

基因組篩查和細胞遺傳學研究顯示，7q存在孤獨癥易感基因座位[1-5]。RELN基因定位在7q22[6]，其表達產(chǎn)物reelin蛋白為3461個氨基酸殘基組成的巨大基質(zhì)外糖蛋白，與神經(jīng)元的正確遷移以及大腦皮層、小腦皮層和海馬等分層結(jié)構(gòu)的正確形成有關(guān)。

研究表明，與reelin蛋白有關(guān)的任一自然突變或定向突變會影響小鼠大腦皮層分層結(jié)構(gòu)的形成，導致胚胎腦的發(fā)育異常。RELN基因突變導致reelin表達異常。研究發(fā)現(xiàn)，孤獨癥患者腦組織和血中reelin水平比對照下降。孤獨癥患者存在海馬、內(nèi)嗅皮質(zhì)、杏仁核、扣帶回皮質(zhì)神經(jīng)解剖異常，包括神經(jīng)元大小和數(shù)目的改變。海馬回負責學習和記憶，孤獨癥患兒的社會行為退縮、強迫行為、不知危險、不能從記憶庫存中提取信息、不能調(diào)節(jié)自己以適應(yīng)新環(huán)境均與海馬回受損有關(guān)；損傷海馬回的動物可以出現(xiàn)刻板行為、自我刺激行為和多動行為。

本研究提示，exon 6 SNP與兒童孤獨癥的嚴重程度有關(guān)：攜帶基因型為G/G的患兒比攜帶基因型A/A的患兒模仿和聽覺反應(yīng)能力差，攜帶基因型為G/G、A/G的患兒比攜帶基因型A/A的患兒有更嚴重的非語言交流障礙。

Weeber等報道，RELN和ApoER2基因共同作用提高海馬的突觸可塑性和學習能力[10]。RELN基因突變與人[11]和鼠[12]學習障礙、小腦發(fā)育不全、共濟失調(diào)和認知障礙明顯相關(guān)。

本研究結(jié)果與其他學者不一致可能由遺傳異質(zhì)性導致，因為兒童孤獨癥是多基因復雜性疾病。也可能由于本研究樣本量較小，進一步研究應(yīng)擴大樣本量并進行家系研究。

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