結(jié)腸癌組織中RASSF1A基因啟動子甲基化狀態(tài)、mRNA表達(dá)變化及意義

李純堅(jiān)，晏 立，文習(xí)剛，羅金波

(湖北省中山醫(yī)院，武漢430033)

RAS相關(guān)區(qū)域家族1A(RASSF1A)基因是從3號染色體短臂克隆出來的抑癌基因，編碼產(chǎn)物具有DNA修復(fù)蛋白XPA功能及調(diào)控細(xì)胞凋亡作用，其表達(dá)異常與多種癌癥的發(fā)病有關(guān)［1］。本研究觀察了結(jié)腸癌組織中RASSF1A基因啟動子甲基化狀態(tài)、mRNA表達(dá)變化。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 2006年1月～2009年12月本院收治的結(jié)腸癌患者80例，男48例，女32例;年齡35～75歲。均經(jīng)結(jié)腸鏡和手術(shù)病理組織學(xué)檢查確診。Dukes分期A期16例、B期24例、C期27例、D期13例。病理組織學(xué)分型腺癌40例、黏液細(xì)胞癌25例、未分化癌15例。留取結(jié)腸癌組織及癌旁正常結(jié)腸組織。

1．2 RASSF1A啟動子甲基化檢測 采用甲基化特異性PCR(MSPCR)技術(shù)。提取結(jié)腸癌組織和癌旁正常結(jié)腸組織中的RASSF1A基因啟動子區(qū)域。提取基因組DNA后按EZ DNA Methylation Kit試劑盒操作，將DNA模板未甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，轉(zhuǎn)化后的樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯影后檢測。

1．3 RASSF1A基因mRNA檢測 采用RT-PCR技術(shù)。根據(jù)RNA提取試劑盒操作說明書提取結(jié)腸癌組織和癌旁正常結(jié)腸組織中RASSF1A基因的RNA，以GAPDH作為內(nèi)參照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯影后檢測。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS12．0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

80例結(jié)腸癌癌旁正常結(jié)腸組織中的RASSF1A基因啟動子未見甲基化，80例結(jié)腸癌組織中有58例(72．5%)RASSF1A基因啟動子處于甲基化狀態(tài)，兩者相比，P ＜0．01。

80例結(jié)腸癌癌旁正常結(jié)腸組織均檢測到RASSF1A基因 mRNA，58例結(jié)腸癌組織中RASSF1A基因啟動子甲基化者未檢測到RASSF1A基因mRNA、22例未甲基化者可檢測到RASSF1A基因 mRNA。RASSF1A基因 mRNA隨著結(jié)腸癌Dukes分期增加而降低，Dukes D期RASSF1A基因mRNA呈完全缺失狀態(tài)。

RASSF1A基因啟動子甲基化與結(jié)腸癌病理分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和Dukes分期有關(guān)(P均＜0．05)，見表1。

3 討論

DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因轉(zhuǎn)錄前修飾途徑之一。在真核細(xì)胞DNA中約80%CpG存在甲基化，主要發(fā)生在基因啟動子的核心序列和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，可延伸至第1外顯子區(qū)域，這些區(qū)域被定義為CpG島。DNA甲基化可引起基因組中相應(yīng)區(qū)域染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變。甲基化結(jié)構(gòu)自身或結(jié)合DNA甲基結(jié)合蛋白(MBP)阻止轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子結(jié)合DNA，從而調(diào)控 mRNA轉(zhuǎn)錄和翻譯［2］，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［3］。

表1 RASSF1A基因啟動子甲基化與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

秦豫培等［4］研究發(fā)現(xiàn)，食管癌組織中RASSF1A基因甲基化率為40%，癌旁正常食管組織為13%;Hu等［5］發(fā)現(xiàn)，肝癌組織RASSF1A基因啟動子甲基化率顯著高于正常肝組織，腫瘤越大、TNM分期越晚，RASSF1A基因啟動子甲基化率越高。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌癌旁正常結(jié)腸組織中的RASSF1A基因啟動子未見甲基化，而在結(jié)腸癌組織中RASSF1A基因啟動子甲基化發(fā)生率高達(dá)72．5%;結(jié)腸癌分化程度越低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及Dukes分期越晚，其RASSF1A基因啟動子甲基化發(fā)生率越高。結(jié)腸癌組織中RASSF1A基因啟動子甲基化者其mRNA表達(dá)缺失。說明RASSF1A基因啟動子甲基化可能與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)。

［1］Yi M，Yang J，Chen X，et al．RASSF1A suppresses melanoma development by modulating apoptosis and cell-cycle progression［J］．J Cellular Physio，2011，226(9):2360-2369．

［2］Tian Y，Hou Y，Zhou X，et al．Tumor suppressor RASSF1A promoter:p53 binding and methylation［J］．PLoS One，2011，6(2):17017．

［3］ Mao WM，Li P，Zheng QQ，et al．Hypermethylation-modulated downregulation of RASSF1A expression is associated with the progression of esophageal cancer［J］．Arch Medi Res，2011，42(3):182-188．

［4］秦豫培，王立東，常志偉，等．食管癌組織與外周血RASSF1A甲基化的檢測及其臨床意義［J］．中華腫瘤防治雜志，2009，16(5):359-361．

［5］Hu L，Chen G，Yu H，et al．Clinicopathological significance of RASSF1A reduced expression and hypermethylation in hepatocellular carcinoma［J］．Hepat Inter，2010，4(1):423-432．