氯化兩面針堿對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用及機(jī)制探討

歐賢紅，廖柳鳳，劉華鋼，李丹妮

(廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧530021)

氯化兩面針堿(NC)是由蕓香科花椒屬植物兩面針的干燥根中提取的一種生物堿［1，2］。研究表明NC具有抗腫瘤活性，可抑制 B16、MCF-7、HS578T、DU145、MPC3 等癌細(xì)胞增殖［3］。2009 ～2010 年，我們觀察了NC對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞(以下簡(jiǎn)稱肝癌細(xì)胞)DNA聚合酶δ催化亞基P125的影響，探討抑制肝癌細(xì)胞增殖的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 SMMC-7721細(xì)胞系購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。NC購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào) 110848-20001，純度大于98%。1640培養(yǎng)液購(gòu)于Thermo Scientific公司。胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物工程材料技術(shù)有限公司。胰蛋白酶、四甲基偶氮唑鹽(MTT)購(gòu)于Amersco公司。羊抗 P125多克隆抗體(Santa Cruz)。HRP標(biāo)記鼠抗GAPDH單克隆抗體(上海康成)。HRP標(biāo)記抗羊IgG(北京中杉金橋)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將肝癌細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞長(zhǎng)至約80%密度時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞集落形成能力測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，稀釋至終濃度為0.25/L單個(gè)分散的細(xì)胞懸液。按每孔4 ml細(xì)胞懸液接種于6孔板，每組平行3孔。24 h后加藥，設(shè)陰性對(duì)照組及給藥組，給藥組予 NC 干預(yù)，質(zhì)量濃度分別為 0.15、0.30、0.60 mg/L。37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)10 d后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗兩遍，Giemsa(Giemsa粉 0.5 g，甘油 22 ml，甲醇33 ml，用時(shí)以1∶9 與Sorensen緩沖液混合)染色，計(jì)數(shù)每孔含50個(gè)細(xì)胞以上的克隆原細(xì)胞集落。計(jì)算集落形成抑制百分率。

1.2.3 細(xì)胞 P125表達(dá)檢測(cè) 采用 Western blot法［4］。細(xì)胞分組及干預(yù)同 1.2.2，常規(guī)消化并收集細(xì)胞，離心后棄上清，用預(yù)冷PBS洗2次，按說(shuō)明書加入RIPA(用前按1∶100加入PMSF)，混勻細(xì)胞，置于冰上30min。4℃，1×104r/min離心10min，吸取上清即為蛋白，取少許進(jìn)行蛋白定量，剩余蛋白質(zhì)－80℃貯存。取上清，BCA試劑盒蛋白定量，組織總蛋白加入上樣緩沖液煮沸變性。80 μg蛋白經(jīng)15%SDS-PAGE膠分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore)，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗4℃過(guò)夜，TBST洗膜后加HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，加入ECL發(fā)光液，經(jīng)ECL檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)。結(jié)果用Quantity One 462軟件分析。GAPDH為內(nèi)參照，以P125灰度值/內(nèi)參照灰度反映P125蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞系集落形成能力 見(jiàn)表1。

表1 NC對(duì)各組細(xì)胞系集落形成能力的抑制率

2.2 P125表達(dá) 對(duì)照組P125水平為0.56±0.11;給藥組 0.6、0.3、0.15 mg/L NC 作用后分別為 0.15±0.08、0.19 ± 0.12、0.37 ± 0.12;與對(duì)照組比較，0.6、0.3、0.15 mg/L NC 作用后 P125 表達(dá)顯著性降低(P ＜0.05)。

3 討論

癌細(xì)胞的惡性增殖與DNA的大量復(fù)制相關(guān)，DNA聚合酶δ是真核生物DNA復(fù)制的最主要復(fù)制酶，可與增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和復(fù)制因子C(RFC)結(jié)合后完成前導(dǎo)鏈和隨從鏈的合成［5］。DNA聚合酶δ的聚合酶和外切酶二者活性位于其催化亞基P125。只有通過(guò)其上的PIP-box和KA-box兩個(gè)PCNA相互作用位點(diǎn)，P125與PCNA相互作用才能發(fā)揮其功能活性［6，7］。

NC是從廣西特有藥用植物兩面針根中分離到的具有抗腫瘤活性的生物堿。有研究表明，NC對(duì)包括肝癌等多種腫瘤均有抑制作用［8］，其可能通過(guò)抑制DNA聚合酶而破壞DNA合成［9］。本研究采用集落形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)NC可明顯抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖。該結(jié)果與我們前期采用MTT法檢測(cè)結(jié)果一致［10，11］。采用 Western blot檢測(cè) P125 蛋白的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)NC可明顯下調(diào)P125的表達(dá)。從而推測(cè)NC有可能通過(guò)下調(diào)P125蛋白的表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的惡性增殖。氯化兩面針堿的抗癌機(jī)制可能是多方面的，既有抑制拓樸異構(gòu)酶Ⅰ、Ⅱ，阻止DNA復(fù)制，產(chǎn)生細(xì)胞毒作用;也有對(duì)DNA堿基對(duì)的嵌入作用，從而阻止DNA合成;還有分子中正電荷與生物大分子上負(fù)電荷的靜電作用以及可能的化學(xué)反應(yīng)。究竟何種途徑更為重要，有待深入研究。

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