抗胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅱ單克隆抗體對(duì)胃癌細(xì)胞株BGC-823的抑制作用

陰秀麗，李 坤，徐昌青，陳自平*

(1山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南250012;2山東省千佛山醫(yī)院;3山東省榮軍總醫(yī)院)

近年研究發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)與腫瘤關(guān)系密切［1］，有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、分化及抗凋亡作用。以往研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血清IGF-Ⅱ明顯升高，且其陽(yáng)性表達(dá)與胃癌細(xì)胞的生物學(xué)特性相關(guān)［2］。為探討抗 IGF-Ⅱ單克隆抗體(單抗)對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞的抑制作用，2008～2010年，我們進(jìn)行了相關(guān)研究。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌細(xì)胞株BGC-823由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院提供，抗IGF-Ⅱ單抗購(gòu)自美國(guó)Upstate公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將BGC-823細(xì)胞復(fù)蘇后移入培養(yǎng)瓶，37℃、5%CO2培養(yǎng)，48 h后更換培養(yǎng)液;細(xì)胞貼壁80%時(shí)再次傳代培養(yǎng)，更換培養(yǎng)液，供實(shí)驗(yàn)用。

1.2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(IR)檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BGC-823細(xì)胞制成2×105個(gè)/ml細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μl;設(shè)空白培養(yǎng)液為對(duì)照組，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度 5、10、20 μg/ml的抗 IGF-Ⅱ單抗 200 μl，對(duì)照組加入等體積二甲基亞砜(DMSO)。每組均設(shè)4個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48 h，培養(yǎng)終止前4 h，每孔加入噻唑藍(lán)10 μl;對(duì)照組終止培養(yǎng)時(shí)，每孔加入DMSO 100 μl;均置搖床低速微振蕩20min，在波長(zhǎng)490 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸光度(A)，計(jì)算IR。

1.2.3 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察 用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)組分別加入10、20 μg/ml的抗IGF-Ⅱ單抗，對(duì)照組不加;培養(yǎng)24、48 h后收集細(xì)胞，離心后制作電鏡標(biāo)本，觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)組分別加入5、10、20 μg/ml的抗IGF-Ⅱ單抗，對(duì)照組不加;培養(yǎng)24、48 h后，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)/ml細(xì)胞懸液，于混勻狀態(tài)下加70%乙醇固定，4℃過(guò)夜。染色前離心、棄去乙醇，用PBS液洗滌2次去除固定液，加1%RNA酶溶液200 μl，37℃水浴30min后加PI染色液200 μl混勻，4℃避光30min，經(jīng)350目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后上機(jī)分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組BGC-823細(xì)胞抑制作用比較 見(jiàn)表1。

表1 兩組BGC-823細(xì)胞抑制作用比較(n=4)

2.2 顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)變化 對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)良好，細(xì)胞呈棱形或多角形。實(shí)驗(yàn)組作用24 h后，細(xì)胞體積變小、變圓，部分細(xì)胞脫落，漂浮在培養(yǎng)基中;隨抗IGF-Ⅱ單抗作用時(shí)間延長(zhǎng)、濃度加大，漂浮在培養(yǎng)基中的細(xì)胞增多。

2.3 電鏡下細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化 對(duì)照組細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)均勻，核膜清晰，胞質(zhì)中的線粒體、核糖體及溶酶體等細(xì)胞器清晰。實(shí)驗(yàn)組作用24、48 h后，部分細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞表面的微絨毛減少甚至消失;細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)許多空泡，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器密度增大，胞質(zhì)腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體等細(xì)胞器雖可辨認(rèn)，但其數(shù)量減少;細(xì)胞核固縮，核內(nèi)染色質(zhì)聚集呈塊狀或月牙狀，可見(jiàn)膜狀物包裹的小體，其內(nèi)含殘存的染色質(zhì)和退變的細(xì)胞器，凋亡小體形成。

2.4 兩組細(xì)胞凋亡率比較 對(duì)照組作用24、48 h，細(xì)胞凋亡率分別為(2.52± 0.31)%、(4.15±0.43)%;實(shí)驗(yàn)組抗 IGF-Ⅱ單抗 5 、10、20 μg/ml作用24 h的細(xì)胞凋亡率分別為(2.89±0.35)%、(5.47 ±0.76)%、(6.61 ± 0.92)%，48 h 分別為(4.65 ± 0.49)%、(6.68 ± 0.87)%、(7.02 ±1.14)%。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P均＜0.01);實(shí)驗(yàn)組5 μg/ml的細(xì)胞凋亡率低于 10、20 μg/ml(P 均 ＜0.01)。

3 討論

IGF-Ⅱ是刺激腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，在肝癌、大腸癌及卵巢癌等組織中呈過(guò)度表達(dá)，能與IGF-ⅠR、IGF-ⅡR特異性結(jié)合，通過(guò)一系列信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)揮生物學(xué)作用。IGF-Ⅱ可促進(jìn)細(xì)胞DNA、蛋白質(zhì)及多糖合成，是強(qiáng)烈的促有絲分裂劑，有促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育的作用;其通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖、對(duì)抗凋亡作用，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，促進(jìn)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)，從而促發(fā)腫瘤形成新生血管，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移。

Zhang等［3］研究發(fā)現(xiàn)，在4個(gè)轉(zhuǎn)基因鼠細(xì)胞系向肝癌轉(zhuǎn)化過(guò)程中，均有IGF-Ⅱ過(guò)度表達(dá);18個(gè)月后，其中2個(gè)IGF-Ⅱ持續(xù)升高20～30倍的轉(zhuǎn)基因鼠細(xì)胞系發(fā)生癌變。Kawamoto等研究顯示，大腸癌組織中的IGF-ⅡmRNA、蛋白明顯增加，加入抗 IGF-Ⅱ單抗后可明顯抑制大腸癌CaCO2細(xì)胞系生長(zhǎng)。Thompson等［4］發(fā)現(xiàn)，人胃癌LIM-1893細(xì)胞能在無(wú)血清培養(yǎng)基中繁殖，表達(dá)IGF-ⅡmRNA，在其培養(yǎng)基中加入20～50 ng/ml的 IGF-Ⅰ后，LIM-1893 細(xì)胞生長(zhǎng)增快 1.7 ～1.8 倍;加入20～50 ng/ml的 IGF-Ⅱ后，細(xì)胞生長(zhǎng)增快1.6～2.0倍;但抗IGF-ⅠR單抗可阻斷IGFs在體內(nèi)外對(duì)LIM-1893細(xì)胞的促增殖作用，表明IGFs對(duì)人胃癌LIM-1893細(xì)胞有促進(jìn)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，抗IGF-Ⅱ單抗對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞有明顯抑制作用，且隨其濃度增高，IR逐漸增大，呈一定濃度依賴性;隨抗IGF-Ⅱ單抗作用時(shí)間延長(zhǎng)，IR逐漸增大，表現(xiàn)出時(shí)間依賴性，其作用24～48 h后IR增大不明顯。提示抗IGF-Ⅱ單抗對(duì)BGC-823細(xì)胞的抑制作用以10～20 μg/ml、作用24～48 h最明顯。其原因可能為:①I(mǎi)GF-Ⅱ與IGF-ⅠR 結(jié)合，激活 N-myc、ras、c-fos等癌基因，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［5］。②胃癌細(xì)胞產(chǎn)生太多IGF-Ⅱ，破壞細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致細(xì)胞因子促生長(zhǎng)作用過(guò)強(qiáng)，細(xì)胞增殖失控［6］。抗IGF-Ⅱ單抗可阻斷上述發(fā)病機(jī)制。

本研究顯示，抗IGF-Ⅱ單抗作用24 h后，顯微鏡下可見(jiàn)BGC-823細(xì)胞體積變小、變圓，部分細(xì)胞脫落，并隨作用時(shí)間延長(zhǎng)、濃度增大，漂浮細(xì)胞數(shù)量增多。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，抗IGF-Ⅱ單抗作用后，部分細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞表面微絨毛減少甚至消失，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)密度增大，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體等細(xì)胞器數(shù)量減少，胞核固縮，核內(nèi)染色質(zhì)濃集呈塊狀，凋亡小體形成。提示抗IGF-Ⅱ單抗可促進(jìn)BGC-823細(xì)胞凋亡，且10～20 μg/ml、作用24～48 h的細(xì)胞凋亡率明顯升高;說(shuō)明抗IGF-Ⅱ單抗中和培養(yǎng)上清中的IGF-Ⅱ，可阻斷或減弱 IGF-Ⅱ作用，促進(jìn) BGC-823細(xì)胞凋亡。

綜上所述，抗IGF-Ⅱ單抗對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞有明顯抑制作用，且呈一定的劑量、時(shí)間依賴性。

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