β防御素1基因-688G/C單核苷酸多態(tài)性與膿毒癥的相關(guān)性

吳水晶，沈寅華，丁恩平，謝美月，馬震俊，周 華

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，杭州310003)

β防御素1(DEFB1)是最早發(fā)現(xiàn)的一種β防御素，它具有較強(qiáng)的廣譜抗菌活性，能夠殺死G+和G－菌、真菌、包膜病毒等多種病原微生物，并且可以趨化未成熟樹突狀細(xì)胞和記憶性T細(xì)胞到局部炎癥反應(yīng)部位發(fā)揮效應(yīng)，在固有免疫和獲得性免疫中發(fā)揮重要作用。本文通過對膿毒癥患者和對照者DEFB1基因啟動(dòng)子區(qū)域－688G/C單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析，探討DEFB1基因啟動(dòng)子區(qū)域－688G/C單核苷酸多態(tài)性與膿毒癥易感性和預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2005年1月～2007年8月我院ICU病房確診為膿毒癥患者211例(膿毒癥組)，男123例、女 88例，年齡(60.6±17.5)歲;死亡 110例，存活101例。膿毒癥診斷嚴(yán)格按照1992年和2001年美國胸科醫(yī)師學(xué)會(huì)和危重醫(yī)學(xué)會(huì)聯(lián)席會(huì)議制定的膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，并排除孕婦及年齡小于18歲的患者。對照組為157例浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院同期擇期手術(shù)后未并發(fā)膿毒癥患者，男96例、女61例，年齡(58.4±18.3)歲。兩組性別、年齡有可比性。

1.2 方法 在獲得患者知情同意后，抽取外周靜脈血10 ml于EDTA抗凝管。每一個(gè)樣本移取200 μl用QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN公司)嚴(yán)格按照說明書提取樣本基因組 DNA。NCBI/Gene Bank網(wǎng)站獲得DEFB1基因全長序列，premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)PCR引物。引物序列如下:上游引物:5'-AGGTTAGGCAGTTCTGATGG-3';下游引物:5'-CCACTGAGACATCAGGAAAG-3'。引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物片段大小為547 bp，由上海生工生物技術(shù)工程技術(shù)服務(wù)公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 μl，包括:ddH2O 14.8 μl;10 × buffer 2.5 μl;dNTP(10 mmol/L)1.0 μl;上游引物(10 pmol/μl)1.0 μl;下游引物(10 pmol/μl)1.0 μl;MgCl2(25 mmol/L)2.5 μl;Taq DNA 聚合酶(5 U/μl)0.2 μl;模板 DNA 2 μl。Mastercycler gradient PCR 儀(德國 Eppendorf公司)中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為:95℃ 3 min，95℃ 10 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，共35 個(gè)循環(huán)。利用Cac8I(New England BioLabs公司)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。酶切后產(chǎn)物片段大小為384 bp和163 bp。酶切體系為 20 μl，包括:ddH2O 14.75 μl;PCR產(chǎn)物 3 μl;10 × buffer 2.0 μl，;Cac8I(4 U/μl)0.25 μl。20 μl的酶切產(chǎn)物，經(jīng) 1.8%的瓊脂糖凝膠電泳和0.1%的溴化乙錠染色方法110 V電壓電泳42 min觀察分析DEFB1－688位點(diǎn)的基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)數(shù)資料用百分比表示，組間基因型和等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)及Fisher's exact檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

膿毒癥組和對照組DEFB1基因啟動(dòng)子區(qū)域－688位點(diǎn)基因型GG、GC、CC分布頻率及等位基因G、C的頻率比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。膿毒癥中死亡組與存活組基因型GG、GC、CC分布頻率，等位基因G、C的頻率比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1、2。

表1 膿毒癥組和對照組DEFB1－688位點(diǎn)基因型和等位基因分布［例(%)］

表2 膿毒癥中死亡組和存活組DEFB1－688位點(diǎn)基因型和等位基因分布［例(%)］

3 討論

DEFB1基因在基因組中單拷貝，但存在多個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(SNPs)，兒童HIV感染相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，DEFB1啟動(dòng)子區(qū)域－44CC基因型與母親HIV感染以及胎兒感染 HIV 風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)［1］;Milanese等［2］在對巴西東北人群中研究發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果;Wallace等［3］研究表明，DEFB1 多態(tài)性(G→20A，C→44G，G→52A and Val38Ile)及其單倍型與吸煙患者肺部感染及其肺功能減退并無相關(guān)性;另外有研究表明，Val38Ile與日本人群患COPD相關(guān)，668C/G多態(tài)位點(diǎn)與中國人群COPD易感性相關(guān)［4］;本研究小組之前研究也發(fā)現(xiàn)，－44G/C單核苷酸多態(tài)性與重癥膿毒癥的易感性和預(yù)后存在相關(guān)性［5］。

本研究發(fā)現(xiàn)，DEFB1基因－688位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率在膿毒癥組和對照組以及膿毒癥組中死亡組和存活組之間均無顯著性差異，與膿毒癥的易感性和預(yù)后無相關(guān)性，與Sun等［6］研究結(jié)果存在差別。我們分析引起這種結(jié)果差異的原因可能有兩點(diǎn):①DEFB1是一個(gè)腫瘤抑制因子，其高表達(dá)可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的生長。因此，攜帶突變體等位基因C的人群由于其體內(nèi)DEFB1水平相對低下，其患前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)相對增加。而DEFB1在膿毒癥中的作用較復(fù)雜，它不僅可以直接殺滅病原微生物，而且可以通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)。②報(bào)告基因技術(shù)只是將DEFB1基因單獨(dú)進(jìn)行分析，并且Sun等［6］只是對轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游79～1 140 bp序列進(jìn)行了研究。因此，DEFB1基因－688G/C多態(tài)位點(diǎn)相對比較獨(dú)立，受其他多態(tài)性位點(diǎn)的影響小。本研究是在整個(gè)基因組中對DEFB1基因－688位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行基因型分析，DEFB1基因－688位點(diǎn)可能和其鄰近位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性存在連鎖不平衡，影響 －688位點(diǎn)對DEFB1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用和DEFB1在固有免疫系統(tǒng)中的功能。

影響膿毒癥發(fā)生發(fā)展的因素很多。各種細(xì)胞因子水平影響膿毒癥的發(fā)生和進(jìn)展，防御素和細(xì)胞因子間也存在著廣泛的聯(lián)系，防御素基因也與鄰近基因廣泛交互影響。因此，將來運(yùn)用高通量、快捷、先進(jìn)的基因分型技術(shù)分析多個(gè)基因、多個(gè)位點(diǎn)的基因型，利用病例—對照關(guān)聯(lián)分析和連鎖不平衡分析方法可能更有利于探索遺傳因素在膿毒癥以及其他多基因疾病中的作用。

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