白藜蘆醇對人腎癌細胞增殖和細胞周期的影響

郭 亮，張新恒，張 楠，單中杰

(1新鄉醫學院研究生處，河南新鄉453003;2鄭州人民醫院)

腎細胞癌是成人泌尿系統中最常見的惡性腫瘤之一，其發生、發展是多基因、多因素共同參與的過程。化學預防是一種新的癌癥對抗策略，能夠延緩、抑制或逆轉癌癥的起始和發展。白藜蘆醇(Res)是植物受到外來侵害時所產生的一種抗毒素，藥理作用廣泛，其屬多酚類化合物。研究發現，其不僅具有抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、神經保護等作用，還可作為一種有效的化學預防劑，抑制前列腺癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、腸癌、甲狀腺癌、垂體腺瘤等多種腫瘤細胞的生長［1～3］，但其對腎癌細胞的增殖和細胞周期影響的報道少見。2010年5月～2011年3月，我們觀察了不同濃度的Res對人腎癌細胞細胞周期的影響及變化規律，旨在為其臨床治療腎癌提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 白藜蘆醇(純度為99%)購自美國Sigma公司;腎癌細胞株786-0(以下簡稱腎癌細胞)購自中科院上海細胞生物學研究所;二甲基亞砜購自Sigma公司;DMEM培養液購自美國HyClone公司;胎牛血清購自北京中杉生物科技公司;原位雜交試劑盒購自武漢博士德公司;流式細胞儀購自德國Partec公司。

1.2 細胞培養及干預腎癌細胞用含有20%胎牛血清，1×105U/L青霉素、鏈霉素的DMEM高糖培養液在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養。收集對數生長期細胞，分別用 12.5、25、50、100 μmol/L的白藜蘆醇處理24 h，并設空白對照組。

1.3 細胞增殖抑制率及細胞周期測定 調整細胞濃度為1×106個/ml。PBS離心洗滌2次后，棄上清，加終濃度為70%的冰乙醇，置4℃冰箱固定過夜;檢測時PBS離心洗滌2次，PI復合染液暗處染色20min上流式細胞儀測定細胞增殖抑制率，分析細胞周期分布。實驗重復3次。

1.4 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件進行方差分析，計量資料用±s表示;兩組均數的比較用t檢驗，方差不齊時先進行變量轉換。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

不同濃度Res對腎癌細胞的增殖抑制率見圖1。不同濃度的Res對腎癌細胞均有明顯的抑制作用，表現為G1期及G2期細胞比例明顯降低，S期比例明顯升高。見表1。

圖1 不同濃度Res對腎癌細胞的增殖抑制作用

表1 不同濃度Res對腎癌細胞周期分布的影響(%，±s)

表1 不同濃度Res對腎癌細胞周期分布的影響(%，±s)

注:空白對照組比較，*P ＜0.05;與12.5 μmol/L 比較，△P＜0.05

Res濃度(μmol/L) G1期 S期 G2期0 75.23 ±2.58 13.17 ±1.36 11.35 ±2.37 12.5 73.19 ±3.63* 16.48 ±3.43* 10.16 ±0.25*25.0 65.28 ±3.10＊△ 24.79 ±3.72＊△ 9.67 ±0.43＊△50.0 57.89 ±4.33＊△ 33.42 ±3.36＊△ 8.76 ±0.87＊△100.0 48.69 ±5.88＊△ 43.61 ±1.67＊△ 7.88 ±0.78＊△

3 討論

Res屬非黃酮類多酚化合物，廣泛存在于葡萄、虎杖、花生等多種植物中，但主要存在于葡萄皮，紅葡萄酒中含量最為豐富。近年來其抗腫瘤作用引起了國內外學者的廣泛關注，成為腫瘤防治的熱點。研究表明Res通過減少G0到G1期細胞和阻滯S期細胞而抑制腫瘤細胞增殖［4］;亦有研究表明，Res對前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、食管癌細胞增殖的影響表現為雙向性，即低濃度的Res促進癌細胞生長，而高濃度Res抑制癌細胞生長［4～7］。文獻報道，Res的促凋亡機制有多種途徑:①通過Fas-FasL(CD95-CD95L)途徑介導淋巴細胞凋亡［8］;②通過p53觸發Ras-MAPK激酶-MAPK信號途徑誘導甲狀腺癌細胞凋亡［9］;③通過增加Bax及Bak蛋白表達、減少Bcl-X蛋白表達并激活Capase-3誘導心肌細胞凋亡等［10］。

本研究結果顯示，12.5 ～100 μmol/L 的 Res均能有效抑制人腎癌細胞增殖(各濃度Res的增殖抑制率均明顯高于對照組);且呈濃度依賴性(隨Res濃度升高，G1期及G2期比例顯著下降，S期比例明顯升高);Res濃度為25 μmol/L時抑制作用已達到最強，繼續升高Res濃度不能提高抑制效果(25 μmol/L 與 50、100 μmol/L 比較，P ＞0.05)。證實Res具有抑制人腎癌細胞增殖的作用，其可能機制為下調 Bcl-2 mRNA、Survivin的基因及 c-MYC表達，上調Bax表達;將細胞阻滯于S期。

總之，Res對人腎癌細胞的增殖具有抑制作用，濃度為25 μmol/L時抑制作用最強。本研究為Res用于腎癌的治療提供了實驗依據。

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