心房鈉尿肽對力竭小鼠腎臟的抗氧化作用及其機(jī)制探討

孫繼新，洪 蘭，于 麗，李海雁，劉麗萍*

(1延邊大學(xué)體育學(xué)院體育教育系，吉林延吉133002;2延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部)

心房鈉尿肽(ANP)于1981年由 De等［1］在心房提取物中被發(fā)現(xiàn)，目前其作為一種快速反應(yīng)型激素的抗氧化作用引起臨床的廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，ANP參與了心力衰竭時的抗氧化過程，具有減輕心力衰竭氧化損傷的作用［2］;對乳鼠心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用［3］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，ANP對力竭小鼠骨骼肌具有抗氧化作用。2010年10月～2011年5月，我們觀察了ANP對力竭小鼠腎臟的抗氧化作用，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 ANP(北京北方生物技術(shù)研究所);KT5823(環(huán)—磷酸鳥苷依賴性的蛋白激酶阻斷劑;購自美國Sigma公司);丙二醛(MDA)及組織蛋白測試盒(南京建成生物工程研究所);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。實驗動物為昆明種小鼠(雄性，體質(zhì)量18～22 g，由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部提供，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為25℃，濕度為70%)。721分光光度計(上海第三儀器廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 力竭小鼠腎組織乳酸(LD)含量測定 將基礎(chǔ)游泳時間的標(biāo)準(zhǔn)差＜10min的18只小鼠隨機(jī)分為對照組、應(yīng)激組和游泳力竭組。對照組直接脫頸處死取腎臟;應(yīng)激組于(30±2)℃的水中自由活動(20±2)s后取腎臟;力竭組尾部負(fù)重(體質(zhì)量的10%)游泳(水深20cm，水溫等同應(yīng)激組)，至力竭(在水下10 s仍不能浮出水面)后立即處死腎臟。腎臟取出后用冰冷的生理鹽水沖洗，濾紙吸干稱重，冰浴下制備成5%的勻漿液。采用化學(xué)比色法測定各組腎組織勻漿液LD含量，嚴(yán)格按照測試盒說明書操作。

1.2.2 血漿ANP水平測定 各組均于取腎臟同時斷頭取血，EDTA抗凝，1 500 r/min離心10min取血漿;放射免疫法［4］測定ANP水平。

1.2.3 ANP對H2O2誘導(dǎo)后腎組織MDA含量的影響 另取24只小鼠脫頸處死，立即取出腎臟，制備成30%的腎臟組織勻漿液分裝，分為對照組、H2O2組、ANP 組、KT5823 組，每管 200 μl;所有試管均置于37℃恒溫水浴中，H2O2反應(yīng)濃度為0.5 mol/L;ANP最終反應(yīng)濃度為1.31 ng/ml;KT5823反應(yīng)濃度為10－5mol/L。按以下步驟操作:①KT5823組加入20 μl的KT5823;其它試管均加等量生理鹽水，震蕩恒溫水浴中孵育15min;②ANP組和KT5823組分別加入ANP 20 μl，其它試管均加等量生理鹽水，孵育15min;③H2O2組、ANP組、KT5823組分別加入20 μl的 H2O2，對照組給等量生理鹽水，孵育15min。采用比色法測定各組MDA含量，嚴(yán)格按測試盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Prism(3.0版)軟件行統(tǒng)計學(xué)處理。計量結(jié)果用±s表示，顯著性差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎組織乳酸含量及血漿ANP水平 見表1。

表1 各組腎臟組織中LD含量和血漿ANP含量(±s)

表1 各組腎臟組織中LD含量和血漿ANP含量(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與應(yīng)激組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

組別 n LD(mmol/g prot) ANP(ng/μl)6 0.39 ±0.01 9.49 ±0.70 6 0.43 ±0.02 9.89 ±1.09力竭組 6 0.56 ±0.04＊＊# 13.15 ±1.65*##對照組應(yīng)激組

2.2 ANP對H2O2作用后腎組織MDA含量的影響 見表2。由表2可見，H2O2組MDA含量明顯高于對照組，說明H2O2已導(dǎo)致腎臟組織損傷;ANP組MDA含量明顯低于對照組，ANP有明顯的抗氧化作用;KT5823組MDA含量明顯升高證實KT5823阻斷了ANP的抗氧化作用。

表2 ANP對H2O2作用后腎臟MDA含量的影響(±s)

表2 ANP對H2O2作用后腎臟MDA含量的影響(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.01;與 H2O2組比較，#P ＜0.001;與ANP組比較，△P＜0.001

組別 MDA含量(nmol/mg prot)H2O2組 11.20 ±0.71*6.67 ±0.17 ANP 組 4.15 ±0.21#KT5823 組 9.28 ±1.35△對照組

3 討論

近年來，ANP的抗氧化作用逐漸成為研究熱點。Fürst等［5］研究結(jié)果表明，ANP 通過激活 Rho GTP酶家族成員(Rac1)、NADPH氧化酶(Nox)及其類似物Nox2來誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞的蛋白激酶磷酸化，認(rèn)為ANP參與了氧化應(yīng)激過程。我們的前期研究表明，外源性ANP對大鼠腎缺血—再灌注損傷具有一定的抗氧化保護(hù)作用［6］;以上均是在病理或正常情況下對ANP抗氧化現(xiàn)象進(jìn)行的初步觀察。另有很多學(xué)者觀察到最大負(fù)荷強(qiáng)度和力竭運動后正常人和耐力運動員ANP水平均顯著提高;表明心臟內(nèi)分泌功能對運動訓(xùn)練具有一定的適應(yīng)性，但這種代償反應(yīng)所起的作用及其作用機(jī)制的研究鮮有報道。

本研究表明，力竭運動小鼠血漿ANP水平明顯增加，此與其他學(xué)者的研究結(jié)果吻合［7，8］。為證明其生成的ANP是否具有抗氧化作用，本研究做了H2O2氧化損傷腎臟的離體實驗，結(jié)果表明ANP組MDA含量明顯低于對照組，表明ANP對H2O2損傷腎臟具有明顯的保護(hù)作用;運動時ANP升高的是一種代償作用，有助于改善和保護(hù)力竭運動時腎臟組織的氧化損傷狀況;ANP的這種抗氧化作用也為治療缺血再灌注導(dǎo)致的腎臟組織氧化損傷提供了依據(jù)。

以往的研究表明ANP在體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用時與心臟、血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、淋巴組織、生殖器官及腎臟組織等以結(jié)合形式存在的A型鈉尿肽受體(NPR-A)結(jié)合，在鳥苷酸環(huán)化酶的催化下，催化底物GTP生成環(huán)一磷酸鳥苷(cGMP)而發(fā)揮其舒張血管、降低血壓、利鈉利尿、抑制細(xì)胞增殖以及參與脂質(zhì)代謝等作用［9，10］。因cGMP的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)是PKG，為了探討運動狀態(tài)下ANP生成增多或增加外源性的ANP其抗氧化作用是否亦通過這條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實現(xiàn)，本研究用PKG阻斷劑KT5823做了預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KT5823能夠阻斷ANP對氧化損傷腎臟組織的保護(hù)作用，說明ANP抗氧化作用是通過增加cGMP依賴性的蛋白激酶途徑實現(xiàn)的。

綜上所述，力竭運動時血漿ANP明顯增加;這種代償反應(yīng)參與了腎臟組織的氧化保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是涌過ANP增加使GTP生成cGMP，從而激活PKG信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實現(xiàn)的。

［1］de Bold AJ，Borenstein HB，Veress AT，et al.A rapid and potent natriuretic response to intravenous injection of atrial myocardial extracts in rats［J］.Life Sci，1981，28(1):89-94.

［2］Shono M，Yoshimura M，Nakayama M，et al.Predominant Effect of A-Type Natriuretic Peptide on Reduction of Oxidative Stress During the Treatment of Patients With Heart Failure［J］.Circ J，2007，71(7):1040-1046.

［3］Laskowski A，Woodman OL，Cao AH，et al.Antioxidant actions contribute to the antihypertrophic effects of atrial natriuretic peptide in neonatal rat cardiomyocytes［J］.Cardiovasc Res，2006，72(1):112-123.

［4］Cho KW，Kim SH，Kim CH，et al.Mechanism basis of atrial natriuretic peptide secretion in beating atria:atrial stroke volume and ECF translocation［J］.Am J Physiol，1995，268(5 pt 2):1129-1136.

［5］Fürst R，Brueckl C，Kuebler WM，et al.Atrial Natriuretic Peptide Induces Mitogen-Activated Protein Kinase Phosphatase-1 in Human Endothelial Cells via Rac1 and NAD(P)H Oxidase/Nox2-Activation［J］.Circ Res，2005，96(1):43-53.

［6］李英順，申東洙.心房鈉尿肽在大鼠腎缺血再灌注損傷中的體外抗氧化作用研究［J］.中國西部科技，2009，11(8):31-32.

［7］Edwards JG.Swim training increases ventricular atrial natriuretic factor(ANF)gene expression as an early adaptation to chronic exercise［J］.Life Sci，2002，70(23):2753-2768.

［8］Gutkowska J，Paquette A，Wang D，et al.Effect of exercise training on cardiac oxytocin and natriuretic peptide systems in ovariectomized rats［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2007，293(1):R267-R275.

［9］Calderone A，Thaikcm，Takahashi N，et al.Nitric oxide，atrial natriuretic peptide，and cyclic GMP inhibit the growth-promoting effects of norepinephrine in cardiac myocytes and fibroblasts［J］.J Clin Invest，1998，101(4):812-818.

［10］Lafontan M，Berlan M，Stich V，et al.Recent data on the regulation of lipolysis by catecholamines and natriuretic peptides［J］.Ann Endocrinol，2002，63(2 Pt 1):86-90.