干細胞移植對馬兜鈴酸腎病大鼠腎臟組織中細胞角蛋白表達的影響及意義

李 維，姜 紅，馮江敏

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽110001)

馬兜鈴酸腎病(AAN)指應(yīng)用含有馬兜鈴酸成分的中草藥(或中成藥)后出現(xiàn)的急慢性腎功能和腎組織結(jié)構(gòu)損害［1］。慢性馬兜鈴酸腎病(CAAN)主要為腎間質(zhì)纖維化改變，是AAN中最嚴重、預(yù)后最差的一型［2］，其發(fā)病機制至今不清，目前尚無有效治療方法。骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)不僅支持造血系統(tǒng)，理論上還可向中胚層和外胚層來源的組織分化(即跨系甚至跨胚層分化)，近年來成為腎臟疾病治療領(lǐng)域的研究熱點。2005年10月～2006年3月，我們觀察了MSCs移植對CAAN大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響，探討MSCs對腎損傷的修復(fù)作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 關(guān)木通水煎劑(2 g生藥/ml，4℃冰箱保存)。健康清潔級Wistar大鼠40只，7周齡，體質(zhì)量(200±5)g，雌性 30只(受體)、雄性10只(供體)，均由中國醫(yī)科大學(xué)動物部提供。一抗:兔抗CK18多克隆抗體及鏈霉親和素生物素—酶復(fù)合物(SABC)即用型試劑盒(武漢博士德公司);Bradford蛋白分析試劑盒(Bio-Rad);TRIzolTM Reagent(美國Invitrogen公司);焦碳酸二乙酯(DEPC，華美生物工程公司);兩步法RT-PCR試劑盒(大連寶生物公司);PCR引物序列(聯(lián)星生物工程有限公司合成)。顯微圖像采集分析系統(tǒng)、凝膠圖像分析系統(tǒng)。Z320型掃描儀(北大方正)。

1.2 MSCs分離、培養(yǎng)及鑒定 取10只供體大鼠吸人性麻醉，切取股骨和脛骨，剝凈肌肉組織，PBS液洗滌2遍，剪去骨兩端;再洗滌2遍，低糖DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔，至股骨呈白色，制成骨髓細胞懸液。收集并混合10只大鼠骨髓細胞，經(jīng)200目鋼篩過濾制成單細胞懸液，離心洗滌2次(1 200 r/min，離心5min)，棄除上清，收集沉淀的骨髓細胞。1.073 Percol1液分離獲得白色有核細胞層;PBS洗滌，棄上清。用含10%(體積分數(shù))胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，以1×105個/ml的密度接種于塑料培養(yǎng)瓶中;置于37℃、5%CO2飽和濃度的CO2孵箱中培養(yǎng)，貼壁細胞達90%左右融合后，以0.25%的胰蛋白酶消化，1∶3的比例傳代培養(yǎng)。傳至第3代時消化、洗滌，細胞計數(shù)板計數(shù)細胞，臺盼藍染色計數(shù)活細胞陽性率≥95%，PBS調(diào)整細胞濃度為2×107個/ml備用。第3代骨髓源細胞經(jīng)胰酶消化、調(diào)整為1×106個/ml的單細胞懸液。流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD34僅有微弱表達，CD29及CD44陽性率達97%以上。

1.3 模型制作及干預(yù) 將30只受體大鼠隨機分為移植組、模型組及對照組各10只。移植組和模型組制作腎損傷模型:關(guān)木通水煎劑10 ml/(kg·d)灌胃，分2次給予，每周連續(xù)用藥5 d，共12周。血、尿、腎組織標本相關(guān)指標檢測均顯示腎功能和結(jié)構(gòu)損害。第12周末移植組經(jīng)尾靜脈注射MSCs 1 ml(2×107個細胞);模型組尾靜脈注射等量生理鹽水。對照組飲用水灌胃12周后經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水。

1.4 觀察項目 于干預(yù)第4周末處死各組大鼠留取腎組織標本。

1.4.1 腎組織病理學(xué)變化 腎組織標本用4%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，置于切片機上切成3 μm厚切片，做蘇木精—伊紅(HE)染色，中性樹膠封片，普通光鏡(×400)下觀察。

1.4.2 腎組織CK18表達測定 均嚴格按試劑盒說明書操作。①CK18蛋白表達采用免疫組化法。腎組織標本置40 g/L中性甲醛溶液中浸泡，石蠟包埋，行連續(xù)3 μm切片;免疫組化染色，嚴格按試劑盒說明書操作。每張切片隨機選取10個高倍(400倍)視野，計算其積分光密度值(IOD值)，取平均值。②CK18 mRNA表達 :RT-PCR法:腎組織總RNA提取及CK18 mRNA測定均嚴格按試劑盒說明書操作。電泳凝膠成像系統(tǒng)照相并保存結(jié)果，測定其光密度值(A值)，計算A/β-actin值(半定量值)。Western法:嚴格按試劑盒說明書操作。采用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析圖像并保存結(jié)果，測定A/β-actin值(半定量值)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量數(shù)據(jù)用±s表示，組間差異采用單因素方差分析，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎組織病理學(xué)變化 對照組腎小管結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)規(guī)則，無間質(zhì)纖維化;模型組腎小管不同程度出現(xiàn)萎縮、擴張，腎間質(zhì)纖維化面積逐漸增大;移植組腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯好于模型組，腎間質(zhì)纖維化明顯改善。

2.2 CK18蛋白表達 CK18蛋白陽性表達為黃褐色，位于腎小管上皮細胞。對照組大部分近端及遠端腎小管上皮細胞胞質(zhì)表達CK18，呈強陽性;模型組可見CK18表達逐漸減少，甚至完全缺乏，特別是嚴重萎縮的腎小管和大面積間質(zhì)纖維化區(qū)域;移植組可見陽性表達隨時間推移逐漸增多，明顯高于模型組，但明顯低于對照組。見表1。

2.3 CK18 mRNA表達 RT-PCR法及Western法顯示的表達情況及趨勢與CK18蛋白表達相同，其表達的半定量值見表1。

表1 各組CK18表達比較(n=10，±s)

表1 各組CK18表達比較(n=10，±s)

注:與模型組比較，*P ＜0.01;與對照組比較，#P ＜0.01

組別 CK18 mRNA表達(半定量值)蛋白表達免疫組化法(IOD值) Western法CK18移植組 0.463 ±0.019*# 22.31 ±3.89*# 0.756 ±0.022*#模型組 0.237 ±0.017 10.51 ±2.96 0.402 ±0.017對照組 0.952 ±0.016 39.35 ±2.48 1.186 ±0.031 F 值 69.465 56.237 63.059 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

3 討論

研究證實，干細胞有分化為腎臟細胞及修復(fù)腎損傷的能力。但亦有研究證實，大部分腎小管修復(fù)并非是通過干細胞增殖而實現(xiàn)的，而可能是遷移至腎內(nèi)或原位的干細胞通過旁分泌作用下調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)或上調(diào)抗炎癥因子發(fā)揮修復(fù)作用［3］;成體干細胞植入缺血組織后并未分化為相應(yīng)的腎小管上皮細胞，而是通過抗凋亡、抗炎和促進增殖和存活等效應(yīng)改善缺血后腎臟的功能［4］。

CAAN是近十年余來為人們所認識一種新的腎小管間質(zhì)疾病［5］，最突出的特征是進展迅速的腎小管萎縮壞死、間質(zhì)纖維化和與腎功能損害不平行的早期嚴重貧血。腎間質(zhì)纖維化是多種腎臟疾病發(fā)展至終末期腎功能衰竭的共同通路，是多種細胞、細胞因子、生長因子共同參與的結(jié)果，其發(fā)病機理尚不十分清楚。許多學(xué)者報道腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化是腎間質(zhì)纖維化的重要機制之一［6，7］，腎小管上皮細胞可轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞，肌成纖維細胞是細胞外基質(zhì)(ECM)的主要分泌細胞，細胞外基質(zhì)的增多直接導(dǎo)致了腎臟纖維化的進展。目前對腎間質(zhì)纖維化尚無有效治療方法，既往在對CAAN發(fā)病機制的研究中已發(fā)現(xiàn)大鼠模型的骨髓細胞與腎組織細胞均減少［8］是造血干細胞特異標志物，因此推測CAAN發(fā)病過程中可能由于各種原因?qū)е铝烁杉毎軗p或缺乏;干細胞移植治療CAAN可能是一種可行而有效的途徑。

細胞角蛋白(CK)是細胞骨架蛋白中間絲的一種類型，具有組織特異性，且理化性質(zhì)穩(wěn)定，是上皮細胞特異性表型標志物，其共分20種亞型，分別為CK1～CK20，每種CK與其所在組織器官的分化有密切關(guān)系，細胞分化的不同階段及不同類型上皮細胞表達不同的CK［9］。CK18是位于細胞內(nèi)的非水溶性纖維性多肽，存在于各種上皮細胞中，是正常腎小管上皮細胞的標志蛋白，正常腎組織近端及遠端腎小管上皮細胞均有一定程度的CK表達，且以遠端小管表達最為明顯［10］，而纖維化和萎縮了的腎小管CK18表達消失。

本研究模型組干預(yù)第4周CK18表達明顯下降，且隨病程延長下降更顯著;而移植組CK18表達明顯高于模型組;腎組織病理學(xué)觀察亦顯示移植組腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯好于模型組，腎間質(zhì)纖維化程度較輕。證實MSCs移植對CAAN腎損傷有修復(fù)作用，其可能機制為促進CK18正常表達。

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