歐美山楊雜種嫩枝微扦插生根相關氧化酶活性變化及繁殖技術1)

閆紹鵬 武曉東 王秋玉 宋興舜 楊瑞華

(東北林業大學，哈爾濱，150040) (黑龍江省農業科學院園藝分院)

歐美山楊雜種(Populus tremula×P.tremuloides)是歐洲山楊和北美山楊的雜交種，具有生長快、耐寒、耐貧瘠、樹形高大、適應性強等特點，是北方山地造林的優良樹種。另外，該樹種材質較軟、細密，潔白，樹干端直，是造紙、膠合板、刨花板等工業的優質原料［1］，目前作為優良用材樹種被許多國家廣泛引進。由于歐美山楊是雜交種，為了保持其較高的雜種優勢，只能采用組培等方法進行微體繁殖［2－4］，幾年的研究表明，雜種無性系的組培繁殖成本很高，繁殖系數低，大大阻礙了歐美山楊雜種大規模的商業化生產［5］。因此，對歐美山楊雜種扦插繁殖研究就顯得極為重要。為了提高植物扦插成活率，人們對扦插生根機理進行了廣泛的研究。研究結果表明，過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、吲哚乙酸氧化酶(IAAO)與植物不定根的發生和發展有著密切的關系。在不定根形成期間，POD和 IAAO活性都呈現一定的變化規律［6－7］。POD的活性與IAAO的分解代謝以及不定根的形成有非常密切的關系［8］。PPO的活性對不定根的形成是十分重要的，“生長素—酚”的縮合物(生根素)是在PPO、POD以及一些其他酶的作用下形成的［9－10］。IAAO 能降解 IAA，調節植物體內的IAA水平，從而影響植物的生長發育。可見，不定根的起源和生長與這3種氧化酶的活性變化有著密切關系。為此，筆者研究了歐美山楊雜種扦插生根過程中這3種酶的活性變化，以及外源激素處理對扦插生根及其POD、PPO、IAAO活性變化的影響，以揭示歐美山楊雜種扦插生根的機理。

1 材料與方法

1.1 插穗采集處理和扦插條件

以5年生歐美山楊雜種優良無性系為母株，2009年4月，剪取其當年生半木質化枝條為扦插材料。選擇陰天采條，在母株上選取莖粗在0.3 cm左右、生長健壯、無病蟲害的當年生半木質化枝條，對剪切下來的插條適當噴水，置于陰涼處防止萎蔫，保持新鮮狀態。將枝條剪成長為2～3 cm、帶1個節間、1片葉子的插穗，切口上平下斜，上切口在葉柄上方0.5 cm處，下切口在葉柄下方1～2 cm處，切口無破裂。每根插條只留1個葉片，葉片剪去2/3，并保留葉柄。制作好的插穗在清水中浸泡，以減少抑制劑對生根的影響，稍后對其采用不同的激素種類、質量濃度和時間進行處理，并以清水處理作為對照。

供試激素為萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)和吲哚乙酸(IAA)，質量濃度分別為 100、300、500 mg·L－1，以清水為對照。插條在試劑中的浸泡時間分別為15、30、60 min，浸泡后插入基質中。扦插基質為河沙，下鋪一層草炭土用以保水。扦插采用斜插法，扦插深度為插穗的1/3～2/5。

扦插后，插條葉面應盡量保持濕潤，噴水次數和噴水量要根據具體情況而定，一般空氣相對濕度要保持在80%左右，后期可適當降低。扦插期間記錄插條的變化情況，扦插20 d后統計插條的生根率、生根數、根長和根徑。

1.2 微扦插試驗設計

按L9(34)正交表進行試驗，試驗因子和水平見表1。不考慮各因子之間的交互作用，9個處理隨機排列，每個處理30個插穗，3次重復，管理一致。

表1 歐美山楊雜種嫩枝微扦插正交試驗因子和水平

1.3 指標與測定方法

1.3.1 生根指標

扦插6 d后開始進行生根形態觀察，每天上午觀察1次;20 d時對生根狀況進行全面調查，即調查插穗生根類型、生根率、生根數、根長、根徑。

1.3.2 酶活性的測定

分別在扦插的當天和扦插后的6、9、12、15 d進行取材，取NAA100 mg·L－1浸泡處理30 min的歐美山楊雜種插穗測定酶活性。POD活性參照文獻［11］測定，IAAO和PPO活性參照文獻［12］測定。POD以每克鮮質量每分鐘內A470變化0.01為1個過氧化物酶活性單位［U/(g·min)］;PPO以每克鮮質量每分鐘A525變化0.01為一個多酚氧化酶活性單位［U/(g·min)］;IAAO以每毫升酶液每小時分解破壞IAA的量(μg)表示酶活力的大小［mg/(h·L)］。

1.4 扦插過程中插穗的形態變化

扦插生根過程根據插穗形態變化可劃分為3個時期，分別為:從扦插當天起到扦插后第6天為愈傷組織形成期，可見少部分插穗基部愈傷組織出現;從扦插后第6天到第9天為生根誘導期，部分插穗皮部可見白色突起;從扦插后第9天到第12天為生根表達期，即，不定根生長期可見不定根突破皮層伸長生長。

1.5 數據處理

試驗測量數據采用EXCEL及SPSS13.0軟件進行方差分析、多重比較及相關分析。

2 結果與分析

2.1 激素處理對歐美山楊雜種嫩枝微扦插生根效果的影響

通過對歐美山楊雜種嫩枝微扦插20 d后生根情況(表2)研究發現，激素處理插穗生根率范圍為14% ～76%，清水對照生根率僅為6%;不定根生根數為1.50～4.62條;不定根根長為2.65 ～5.96 cm;不定根根徑為1.30 ～3.00 mm。在扦插試驗過程中發現，根生長部位大多位于插穗基部的皮部，極少由愈傷組織生根，還有些插穗與其他同期扦插的生根插條相比僅出現了發達的愈傷組織而沒有生根。因此，歐美山楊雜種嫩枝扦插生根為皮部生根類型。

對歐美山楊雜種嫩枝微扦插正交試驗結果進行方差分析的結果表明(表3):激素種類對生根率、根長影響差異極顯著，對根徑影響差異顯著;激素質量濃度對生根率影響差異顯著;處理時間對生根率、生根數、根長和根徑影響的差異不顯著。

表2 正交試驗結果

表3 正交試驗方差分析結果

2.1.1 激素種類對生根的影響

不同激素種類對插條的生根率、根長和根徑影響顯著，對生根數影響不顯著。用NAA、IBA和IAA處理插條的生根率差異極顯著。根據LSD多重比較(表4)來看，NAA處理后扦插生根率顯著高于IBA和IAA，IBA和IAA生根率差異不顯著，但均高于對照;NAA處理所得不定根的數量較多，高于IBA和IAA，也高于對照;NAA處理的插條所發生的不定根短粗，相對健壯，而IAA和IBA處理的插條所發生的不定根相對細長;3種激素對于扦插生根數影響不顯著。綜合來看，NAA對插條促進生根效果明顯好于IBA、IAA和對照。歐美山楊雜種扦插平均生根率 NAA(65.33%)＞IAA(31.00%)＞IBA(26.62%)＞清水(6%)。

不同質量濃度的激素處理對插條的生根率影響顯著，而對于生根數、根長和根徑影響不顯著。3種激素處理都表現出在質量濃度低時有利于生根，而質量濃度過高則抑制生根。即插穗中內源激素基本滿足生根要求，如果再使用外源激素，應以低的質量濃度為宜，若質量濃度過高，則會抑制生根和根發育。試驗結果表明，與對照相比，不同質量濃度的3種激素均可提高生根率，最適合歐美山楊雜種扦插生根的質量濃度為NAA100 mg·L－1，平均生根率為65.33%。不同質量濃度的激素處理對歐美山楊雜種扦插枝條的生根數目及根長、根徑影響較小。

2.1.2 激素處理時間對生根的影響

不同浸泡時間對歐美山楊雜種扦插枝條的生根率有影響(表4)，但不顯著，生根率較高的處理時間為NAA30 min。各處理時間的插穗生根率、生根數、根長和根徑沒有差異。說明處理時間對歐美山楊雜種扦插特性影響不顯著。

2.1.3 扦插生根各指標間的相關性

通過扦插生根各指標間的相關分析可以看出(表5)，插穗生根率和根徑、生根數存在顯著正相關，生根率和不定根根長相關性較小;根徑和根長存在負相關。

表4 激素種類、質量濃度對生根影響及LSD多重比較

表5 扦插生根各指標間的相關系數

2.1.4 歐美山楊雜種嫩枝微扦插生根效果

扦插繁殖的插穗長度多為8～12 cm，本試驗采用的插穗長度僅為2～3 cm，因此叫微扦插。相比之下，歐美山楊雜種微扦插具有插穗短、每棵母株出穗率高、出苗時間短、扦插成本低等特點，通過試驗摸索出適合的微扦插條件進行溫室容器大規模微扦插育苗是可行的。試驗中，各試驗處理的最高生根率為76%，可以滿足林業生產需要。

利用NAA和IBA、IAA處理歐美山楊插穗對扦插生根率的提高均有顯著效果，且NAA的效果明顯好于IBA和IAA。綜合生根率、生根數、根長和根徑4個指標，試驗條件下，外源生長調節劑NAA100 mg·L－1處理歐美山楊雜種嫩枝微插穗為最佳處理組合，生根效果好，生根率達到76%。

2.2 歐美山楊雜種扦插生根過程中酶活性的變化

2.2.1 扦插生根過程過氧化物酶(POD)活性變化

POD是普遍存在于植物體內的含鐵卟啉輔基的酶，不僅在植物的氧化脅迫中發揮作用，而且它還參與植物體內的多種生理生化過程，與一些高等植物的發育進程有密切關系，在細胞生長、分化的調節中及發育進程中起著重要作用［13］。POD同工酶在植物體內存在發育階段特異性和組織特異性，外界因子可以通過POD影響植物器官的生理狀態及發育方向，被認為是與生根有關的重要酶類，Garspar等將POD視為生根標志之一［14－15］。

從表6可知，在生根過程中，歐美山楊雜種插穗POD的活性總體上呈上升趨勢。插穗在誘導期(6～9 d)POD活性上升較快，處理插穗在插后9 d時POD活性達到最高。對照插穗的POD在生根過程中變化較緩，總體上與處理相似，但POD活性在生根過程中低于對照。處理插穗的POD活性在不定根形成過程明顯高于對照，這可能與植物生長調節劑(外源激素)作用有關，即外源NAA處理引起了插穗內過氧化物酶扦插生根過程中活性的變化。

表6 歐美山楊雜種扦插生根過程中的酶活性

2.2.2 扦插生根過程中吲哚乙酸氧化酶(IAAO)活性變化

吲哚乙酸(IAA)在植物扦插不定根生成過程中起著重要作用，而任何影響植物內源IAA含量變化的因素勢必影響不定根的發生。IAAO可以氧化IAA，因此IAAO活性的大小與扦插過程中不定根的發生有重要關系。Gaspar等［16］試驗表明，離體生根過程中，高活性的吲哚乙酸氧化酶使內源IAA水平降低是生根誘導期的特點之一，質量分數低的IAA有利于生根。在表達期要求IAA的質量分數較高，以促進根的生長，但此階段吲哚乙酸氧化酶表現活性降低。

從表6中可知，本研究中，處理插穗在扦插過程中IAAO活性先升高后降低，而對照中的IAAO活性則緩慢上升，變化較小。不定根誘導期，IAAO活性逐漸上升，使體內IAA活性降低，有利于根原基的生長。不定根表達期，IAAO活性下降，有利于不定根原基的表達生長。

2.2.3 扦插生根過程中多酚氧化酶(PPO)活性變化

高等植物中普遍存在多酚氧化酶(PPO)，這種酶不僅在植物的生長、發育中起重要的作用，而且對植物的器官形態建成也起到非常重要的作用［17］。PPO能催化生長素的代謝，促進不定根的起源與發育。在插條生根過程中，酚類物質對不定根的發生和發育起著極其重要的作用［18］，PPO可以催化酚類物質并與IAA形成一種IAA—酚酸復和物，這種復合物是一種生根的輔助因子，具有促進不定根形成的活性。

從表6中可知，在歐美山楊雜種扦插生根過程中，PPO活性先升高后下降再升高，在扦插后6～9 d的根原基誘導期，處理插穗的PPO活性最高，不定根表達期PPO活性則下降。在扦插初期，對照插穗的PPO活性較低，合成的生根輔助因子少，不利于插穗不定根的誘導，因此不定根表達較晚，生根率低。

3 結論與討論

研究表明，歐美山楊雜種為皮部生根類型。利用NAA、IBA和IAA處理歐美山楊插穗對扦插生根率提高均有效果，且NAA的效果明顯好于IBA和IAA。外源NAA處理歐美山楊雜種插穗扦插生根的最佳質量濃度為100 mg·L－1，最高生根率可以達到76%。

歐美山楊雜種插穗生根與POD、PPO和IAAO活性密切相關。在扦插生根過程中，POD、PPO和IAAO活性有規律地變化。在扦插后愈傷組織的形成期，3種酶活性均有上升，其后各自呈現一定的規律性。不定根誘導期IAAO活性高，有利于降解體內高質量分數的IAA，促進根的誘導，表達期IAAO活性下降，內源IAA的質量分數增加，促進根的生長。POD和IAAO活性變化趨勢相似，均表現為誘導期上升、表達期活性下降。PPO在生根誘導期維持較高活性，在表達期先降低、后升高。扦插后處理插穗的POD、PPO活性均高于對照，說明POD和PPO活性的增加能夠顯著提高插穗的生根率。

不同處理插穗的生根效果可能與外源生長素處理改變了生根過程中酶的活性和相互關系有關。不同外源激素種類、質量濃度處理與歐美山楊雜種插穗中POD、PPO、IAAO活性變化的關系，有待進一步研究。

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