左乙拉西坦與拉莫三嗪對(duì)海馬細(xì)胞保護(hù)的對(duì)比研究

雷 軍,張占萍,鐘雨秋,王為民

顳葉癲癇占所有癲癇類型的30%～35%,常為難治性癲癇,其結(jié)構(gòu)特征為海馬硬化[1],而細(xì)胞凋亡是顳葉癲癇海馬神經(jīng)元丟失導(dǎo)致海馬硬化的重要途徑[2]。本研究比較新型抗癲癇藥物拉莫三嗪和左乙拉西坦對(duì)戊四氮致癇大鼠海馬細(xì)胞凋亡的影響,對(duì)比兩者對(duì)海馬細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 普通級(jí)健康成年雄性Wistar大鼠,體重260 g～300 g,蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。110只Wistar大鼠按體重隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性藥物對(duì)照組(丙戊酸低、中、高劑量組)、治療組 1(拉莫三嗪低、中、高劑量組),治療組2(左乙拉西坦低、中、高劑量組)共 11組,每組 10只。

1.1.1 試劑及藥物 戊四氮由美國(guó)Serva公司生產(chǎn)。免疫組化試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)。丙戊酸鈉由湖南湘中制藥有限公司生產(chǎn)。拉莫三嗪由葛蘭素史克公司生產(chǎn)。左乙拉西坦由比利時(shí)聯(lián)合化工生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 癲癇模型制備 模型組、各陽性藥物對(duì)照組和各治療組大鼠每天腹腔注射戊四氮35 mg/kg,并觀察其行為學(xué)變化30 min。行為學(xué)判斷按 Racine分級(jí)法[3],Ⅰ級(jí):濕狗樣顫動(dòng),面肌抽動(dòng)、咀嚼;Ⅱ級(jí):節(jié)律性點(diǎn)頭;Ⅲ級(jí):前肢陣攣;Ⅳ級(jí):站立伴前肢陣攣;Ⅴ級(jí):失平衡、傾倒、四肢抽動(dòng)、全身陣攣。以連續(xù)出現(xiàn)3次Ⅳ級(jí)以上發(fā)作作為點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn),正常組給予同體積生理鹽水腹腔注射。全部點(diǎn)燃后,按丙戊酸、拉莫三嗪和左乙拉西坦人的最大推薦劑量(丙戊酸鈉3 000 mg/d,拉莫三嗪600 mg/d,左乙拉西坦4000 mg/d)的1/30,1/20,1/10分別為丙戊酸、拉莫三嗪和左乙拉西坦低、中、高劑量組,即丙戊酸低劑量組[100 mg/(kg?d)],中劑量組[150 mg/(kg? d)],高劑量組[300 mg/(kg? d)];拉莫三嗪低劑量組[20 mg/(kg? d)],中劑量組[30 mg/(kg? d)],高劑量組[60 mg/(kg? d)];左乙拉西坦低劑量組[130 mg/(kg?d)]中劑量組[200 mg/(kg?d)]高劑量組[400 mg/(kg?d)]。模型組、正常對(duì)照組給予同體積生理鹽水。丙戊酸、拉莫三嗪和左乙拉西坦配制方法及動(dòng)物給藥:丙戊酸、拉莫三嗪和左乙拉西坦用生理鹽水配成所需濃度;大鼠給藥容積1 ml/100 g,每天灌胃給藥一次,共 3周。

1.2.2 取材和制片 藥物治療3周結(jié)束后各組大鼠進(jìn)行心臟灌注固定,取海馬組織。將組織塊用4%中性甲醛固定4 h后,在20%的蔗糖中過夜,常規(guī)制作蠟塊,切片。

1.2.3 免疫組化檢測(cè) 每只大鼠取2張腦片,分別用于bax,bcl-2檢測(cè)。免疫組化染色采用S-P法。Bax、Bcl-2陽性細(xì)胞為細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒,陰性對(duì)照細(xì)胞核染為藍(lán)色且細(xì)胞核或胞漿內(nèi)無棕黃色顆粒。

1.2.4 圖像分析和數(shù)據(jù)處理 每張切片隨機(jī)選取5個(gè)完整而不重疊的高倍鏡視野(×400)計(jì)數(shù)Bax、Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù),然后求其平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行處理,檢測(cè)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠行為學(xué)觀察 行為學(xué)按Racine法[3]分級(jí)判斷:正常組無癲癇發(fā)作;模型組在注射戊四氮后3 min～6 min出現(xiàn)眨眼、動(dòng)須、節(jié)律性點(diǎn)頭、肢體抽搐及跌倒等。多為Ⅳ級(jí)～Ⅴ級(jí),部分出現(xiàn)強(qiáng)直陣攣,甚至出現(xiàn)前、后肢伸肌強(qiáng)烈收縮,同時(shí)伴有喉鳴、口鼻流出血性泡沫、肢端青紫等。各陽性藥物對(duì)照組、各治療組在注射戊四氮后3 min～8 min出現(xiàn)眨眼、動(dòng)須、節(jié)律性點(diǎn)頭、肢體抽搐等,多數(shù)表現(xiàn)為Ⅲ級(jí)～Ⅳ級(jí),少數(shù)為Ⅴ級(jí)而且僅表現(xiàn)跌倒,個(gè)別出現(xiàn)強(qiáng)直陣攣。行為學(xué)觀察結(jié)果顯示正常組沒有癲癇發(fā)作,各陽性藥物對(duì)照組與模型組比較發(fā)作開始時(shí)間延遲,發(fā)作級(jí)別下降;拉莫三嗪各組和左乙拉西坦各組與模型組比較發(fā)作開始時(shí)間未見延遲,發(fā)作級(jí)別未見下降。

2.2 免疫組化結(jié)果 在模型組中,Bcl-2和Bax表達(dá)都增加,陽性藥物對(duì)照各組和治療各組與模型組比較Bcl-2表達(dá)增加和Bax表達(dá)減少,說明左乙拉西坦、拉莫三嗪和丙戊酸都具有通過Bcl-2表達(dá)增加和Bax表達(dá)下降來抑制凋亡的作用,其中左乙拉西坦和拉莫三嗪抑制凋亡的作用隨劑量的增加作用增強(qiáng),其中,低劑量組中,左乙拉西坦優(yōu)于拉莫三嗪和丙戊酸,而后兩者基本相同,中、高劑量組中,左乙拉西坦和拉莫三嗪均優(yōu)于丙戊酸,而拉莫三嗪和左乙拉西坦基本相同。模型組與正常組比較Bax陽性細(xì)胞數(shù)增加,而Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)也增加(P＜0.01);各陽性藥物對(duì)照組和各治療組分別與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。詳見表 1。

表1 拉莫三嗪對(duì)大鼠海馬Bcl-2和Bax表達(dá)的影響(±s)

表1 拉莫三嗪對(duì)大鼠海馬Bcl-2和Bax表達(dá)的影響(±s)

組別 Bax Bcl-2正常組 9.91±0.34 9.94±0.44模型組 19.96±0.291) 20.30±0.521)丙戊酸低劑量組 17.09±0.372) 22.53±0.542)丙戊酸中劑量組 13.90±0.292) 25.08±0.482)丙戊酸高劑量組 11.18±0.652) 30.15±0.512)拉莫三嗪低劑量組 16.90±0.682) 22.84±0.462)拉莫三嗪中劑量組 13.49±0.432) 25.56±0.402)拉莫三嗪高劑量組 10.45±0.422) 31.02±0.272)左乙拉西坦低劑量組 15.18±0.302)3) 24.21±0.472)3)左乙拉西坦中劑量組 13.50±0.382) 25.49±0.372)左乙拉西坦高劑量組 10.26±0.362) 31.14±0.332)與正常組相比,1)P＜0.01;與模型組比較,2)P＜0.01;與 拉莫三嗪組比較,3)P＜0.05

3 討 論

顳葉癲癇典型的病理改變包括神經(jīng)細(xì)胞丟失,苔蘚纖維芽生和膠質(zhì)細(xì)胞增生,其中細(xì)胞凋亡是顳葉癲癇海馬神經(jīng)元丟失重要的途徑[2]。

凋亡總體上有兩種途徑即內(nèi)源性途徑和外源性途徑,內(nèi)源性途徑是通過調(diào)節(jié)線粒體釋放細(xì)胞色素C來激活CASPASE9,外源性途徑是通過激活細(xì)胞表面受體如FAS來激活CASPASE8或者CASPASE10[4],tBid(truncated Bid)提供內(nèi)源性和外源性途徑的連接[5]。決定是否處于凋亡狀態(tài)的一個(gè)重要的因素是Bcl-2家族促凋亡成員如Bax,Bak等和抗凋亡成員如Bcl-2,Bcl-xl之間的平衡[2],同時(shí)Bcl-2家族也是癲癇發(fā)作引起的腦細(xì)胞凋亡的主要調(diào)節(jié)因素,通過下調(diào)抗凋亡成員Bcl-2和上調(diào)促凋亡成員 Bax來促凋亡[6]。本實(shí)驗(yàn)中,模型組中 Bcl-2和Bax表達(dá)都增加,說明機(jī)體處于凋亡狀態(tài)時(shí)隨著促凋亡成員Bax的表達(dá)增強(qiáng),抗凋亡成員Bcl-2也表達(dá)增強(qiáng),而各陽性藥物組和各治療組表現(xiàn)為Bcl-2表達(dá)增加Bax表達(dá)減少,說明左乙拉西坦、拉莫三嗪和丙戊酸都可以通過增加抗凋亡成員Bcl-2的表達(dá)和減少促凋亡成員Bax表達(dá)來起到抑制凋亡,保護(hù)海馬細(xì)胞的作用。

左乙拉西坦、拉莫三嗪和丙戊酸目前已廣泛應(yīng)用于癲癇的治療,其具有抗癲癇和神經(jīng)保護(hù)雙重作用[7]。本實(shí)驗(yàn)中,丙戊酸使戊四氮點(diǎn)燃的慢性癲癇大鼠發(fā)作起始時(shí)間延遲,發(fā)作級(jí)別有下降趨勢(shì),未出現(xiàn)強(qiáng)直陣攣;而左乙拉西坦和拉莫三嗪對(duì)戊四氮點(diǎn)燃的慢性癲癇模型無抗抽搐作用,但三者對(duì)大鼠海馬區(qū)細(xì)胞Bcl-2表達(dá)增加和Bax表達(dá)減少與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,都有抑制凋亡的作用從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。其中,左乙拉西坦在各種劑量,拉莫三嗪在中高劑量時(shí)對(duì)大鼠海馬區(qū)細(xì)胞Bcl-2表達(dá)增加和Bax表達(dá)減少與丙戊酸比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。左乙拉西坦、拉莫三嗪在抑制細(xì)胞凋亡,神經(jīng)保護(hù)方面優(yōu)于丙戊酸,推測(cè)與左乙拉西坦和拉莫三嗪存在獨(dú)立于抗癲癇作用的神經(jīng)保護(hù)作用相關(guān)[8,9]。同時(shí)左乙拉西坦低劑量應(yīng)用即顯示出抗凋亡神經(jīng)保護(hù)作用,而拉莫三嗪在中高劑量時(shí)與左乙拉西坦具有相似的神經(jīng)保護(hù)作用,作為神經(jīng)保護(hù)劑應(yīng)用中注意劑量的選擇。

本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)兩藥具有確切的抗海馬細(xì)胞凋亡,神經(jīng)保護(hù)作用,相信左乙拉西坦及拉莫三嗪作為神經(jīng)保護(hù)劑具有很好的發(fā)展前景。

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