重組人紅細胞生成素對大鼠腦缺血再灌注損傷后XIAP及Smac蛋白表達的影響

郭麗君,袁慧欣,闞衛軍,喬振華,薛福平

腦組織局部神經細胞過度凋亡是造成腦缺血再灌注損傷的主要原因之一。近來研究發現,重組人紅細胞生成素(rh-EPO)對腦缺血再灌注損傷具有神經保護作用[1],可能與抑制線粒體凋亡途徑介導的細胞凋亡有關,而rh-EPO對腦缺血再灌注損傷后神經細胞凋亡抑制蛋白(XIAP)、Smac蛋白表達的影響鮮見報道。本研究觀察了大鼠腦缺血再灌注損傷后XIAP及Smac蛋白表達的變化情況,探討 rhEPO對 XIAP及Smac蛋白表達的影響及神經保護作用的可能分子機制,為臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康雄性Wistar大鼠70只,體重220 g～250 g,山西醫科大學生理實驗室提供。XIAP兔抗大鼠多克隆抗體(博奧森公司);Smac兔抗大鼠多克隆抗體、TUNEL凋亡檢測試劑盒、DAB顯色劑(均購自北京中杉金橋);rh-EPO(成都地奧);0.23 mm市售漁線;BI-2000醫學圖像分析系統、PM-10AD光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 參照Zea longa線栓法加以改良制備大鼠右側大腦中動脈阻斷(MCAO)局灶性腦缺血再灌注模型[2]。阻閉1 h后抽出漁線,恢復再灌注。假手術組置入10 mm即可,余步驟同模型組。在缺血期間及再灌注后1h保持體溫在(37±0.5)℃。

各組均在術后1 h～2 h大鼠清醒時參照Bederson評分標準[3]進行神經功能缺失體征評分。造模成功的判斷標準:以清醒后左側前肢不能完全伸展,前進時向左側轉圈、傾倒,并出現霍納征為模型成功的判斷標準,不成功者剔除,再隨機補充。

1.2.2 分組及標本制備 實驗分為3組,假手術組 20只,缺血組及 rh-EPO治療組,每組25只。于再灌注后即刻,假手術組及缺血組腹腔內注入0.3mL生理鹽水;治療組腹腔內注入rh-EPO(2 500 U/kg),共 5 d。分別于再灌注后 6 h、12 h、24 h、72 h、7d處死大鼠,斷頭、取腦,去除小腦與腦干,在視交叉前后1 mm范圍切取組織,于4%多聚甲醛中4℃固定24 h,常規梯度乙醇脫水,石蠟包埋,連續切取厚約 3 μ m的冠狀切片,行TUNEL法檢測細胞凋亡、免疫組化檢查。

1.3 檢測指標

1.3.1 TUNEL法檢測細胞凋亡 按照原位TUNEL試劑盒說明書進行凋亡染色,細胞核中出現棕褐色顆粒者為陽性細胞。

1.3.2 Smac、XIAP蛋白免疫組化染色檢查采用SP法,具體操作步驟按說明書進行。顯微鏡下胞漿或胞核有棕色顆粒者為陽性細胞,每只動物隨機取3張切片,每張切片在400倍視野下隨機選取不重疊的5個視野計數,取均數。

2 結 果

2.1 神經細胞凋亡情況 缺血組中各時間點凋亡細胞數均顯著增加;rh-EPO組陽性反應細胞數均明顯減少,著色較淺,與缺血組、假手術組比較有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 Smac蛋白表達 假手術組偶見少量散在Smac蛋白陽性表達,位于胞漿,黃染;缺血組于再灌注6 h有大量Smac陽性細胞出現,位于神經元胞漿及胞核,24 h到達高峰,隨后減少,72 h基本降至正常。與缺血組比較,rh-EPO組各時間點Smac陽性細胞均減少(P＜0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠皮質Smac蛋白陽性表達(±s)

表1 各組大鼠皮質Smac蛋白陽性表達(±s)

組別 6 h 12 h 24 h 72 h 7 d假手術組 2.67±0.23 3.25±0.94 4.62±1.06 3.78±1.56 2.69±0.51缺血組 31.21±2.31 46.78±3.21 50.67±2.84 37.82±1.93 30.65±3.92 rh-EPO 組 19.76±3.571) 29.62±3.251) 32.61±5.931) 25.76±4.251) 20.68±1.931)與缺血組比較,1)P＜0.05

2.3 XIAP蛋白表達 胞漿或胞核上見黃染者即為陽性細胞。再灌注6 h大鼠XIAP的表達增多,12 h達高峰,之后逐漸下降,72 h XIAP的表達雖然較假手術稍高,但差異無統計學意義。與缺血組比較,rh-EPO組各時間點XIAP陽性細均增加,

72 h仍較6 h明顯升高,7 d降至正常。詳見表2。

表2 各組大鼠皮質XIAP蛋白陽性表達(±s)

表2 各組大鼠皮質XIAP蛋白陽性表達(±s)

組別 6 h 12 h 24 h 72 h 7 d假手術組 9.21±0.78 14.52±4.06 13.24±3.81 12.89±4.12 10.67±2.14缺血組 14.08±6.21 20.92±5.43 17.31±5.35 15.67±4.95 14.92±6.78 rh-EPO 組 21.65±6.271) 39.87±4.561)2) 34.64±3.721)2) 28.92±3.411)2) 23.62±1.531)與缺血組比較,1)P＜0.05;與 rh-EPO組6 h比較,2)P＜0.05

3 討 論

腦缺血再灌注后,腦組織可發生壞死和凋亡兩種死亡形式,梗死中心以壞死為主,梗死邊緣區(即缺血半暗帶)以凋亡為主,由于凋亡早期改變是可逆的,因此,挽救缺血半暗帶區神經元,減少神經元凋亡的發生,就能明顯減輕腦梗死的程度和范圍。

rh-EPO作為中樞神經系統中一個新的信號轉導分子和神經營養及保護因子,對腦缺血再灌注損傷有保護作用。降低谷氨酸鹽毒性;抑制神經細胞凋亡;誘導神經遞質的釋放,直接或間接影響神經傳導;減輕炎癥反應;直接的抗氧化作用;保護腦血管內皮,促進腦血管增生等[4,5]。

rh-EPO抑制神經細胞凋亡與Caspase通路密切相關。rh-EPO可通過阻斷Caspase-3、Caspase-9等的激活[6],上調bcl-2和bcl-xl基因表達,對抗凋亡的發生[7]。而 rh-EPO對腦缺血再灌注損傷后神經細胞XIAP、Smac蛋白表達的影響鮮見報道。

XIAP是一種內源性凋亡蛋白抑制劑,被認為是迄今作用最強的內源性Caspases抑制因子,其特征性功能結構為氨基端的3個桿狀病毒重復序列結構(Baculoviral IAP repeat,BIR)及羧基端具有泛素連接酶E3活性的環指結構域(Ring finger domain,RING)[8]。XIAP抑制Caspase的活性:直接通過BIR結構域與Caspases-3、Caspase-7、Caspase-9結合而抑制其活性;通過RING指結構域的泛素化、溶酶體降解而抑制Caspases降解。本實驗觀察到,再灌注6 h神經元中XIAP蛋白表達增高,12 h達高峰,以后受到表達上調的Smac抑制、Caspase-3激活后的降解增強及自身進行泛素化而降解,很快下降,至72 h恢復正常。治療組XIAP陽性細胞數明顯增多,且72 h還有較強表達,提示治療組可能通過促進XIAP表達或抑制其降解,從而抑制Caspase活性、保護神經功能,對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。

Smac(第二種天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶激活物)是一種重要的促凋亡蛋白[9],可負性調控XIAP抑制Caspases活性的作用。正常情況下Smac位于線粒體內膜腔,受到凋亡信號刺激線粒體膜孔開放后移位到胞漿,與Apaf-1凋亡復合體、XIAP的BIR3、BIR2結構域競爭性結合解除其對Caspase-9、Caspase-3的抑制,及拮抗XIAP環指結構域泛素連接酶E3活性等多種途徑增加細胞對凋亡信號的敏感性,促進細胞凋亡的發生[10]。本實驗結果顯示,正常腦組織中有少量Smac蛋白表達,腦缺血再灌注后Smac蛋白表達逐漸增高,高峰出現在再灌注24 h,并且少量細胞表現為核染色陽性,說明Smac參與了腦缺血后神經細胞死亡過程。治療組Smac陽性細胞數減少,提示治療組可能通過減少Smac表達,對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。

rh-EPO對腦缺血再灌注損傷有明顯的神經保護作用,提高神經功能,減少腦組織凋亡細胞數,可能與抑制Smac蛋白表達,增加XIAP蛋白表達有關。rh-EPO可影響XIAP/Smac通路,減輕腦缺血再灌注后神經元損傷及細胞凋亡,是rh-EPO腦保護作用的分子機制之一。

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[5]丁正斌,全偉,曹志愷,等.不同療程促紅細胞生成素對大鼠腦缺血再灌注損傷后神經細胞凋亡的影響[J].中華神經醫學雜志,2007,6(11):1122-1125.

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