Shh在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及其臨床意義研究

邊學海,趙吉生,薛 輝,張 廣,張大奇,周 樂,孫 輝*

(吉林大學1.中日聯誼醫院甲狀腺外科;2.中日聯誼醫院胃腸外科;3.白求恩醫學院組織胚胎教研室,吉林長春130033)

甲狀腺癌是最常見的內分泌系統的惡性腫癌(＞90%)。近期的流行病學調查顯示,其發病率呈上升趨勢[1]。甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid Carcinoma,PTC)是甲狀腺癌最常見的病理類型,約占甲狀腺癌的60%-80%。盡管多數的PTC患者預后較好、并能長期生存,但部分腫癌仍顯示浸潤性行為并發展成為更具浸潤性和致命性的未分化甲狀腺癌。研究表明PTC的發生發展與多種因素相關,最近國外報道Sonic hedgehog通過激活癌基因等作用與多種惡性腫瘤的發生發展密切相關,而其在PTC發生中的作用尚有待證實。本研究擬對Shh信號通路關鍵分子Shh蛋白在PTC中的表達情況進行觀察,分析它的表達特點及其與PTC臨床病理特征的關系,以探討Shh信號通路與PTC發生、發展的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床資料 選取我院2009年1月至8月期間術后病理確診為甲狀腺乳頭狀癌患者病理蠟塊標本142例,每例標本均包括癌組織和癌旁組織(距腫瘤1-2 cm以遠并經病理證實的非癌組織)。男37例,女 105例 ,男女比例 1∶2.84;年齡 20-62 歲 ,中位年齡 42.4歲。根據 2009年美國甲狀腺學會(ATA)分期,本組TNM 分期:Ⅰ期103例,Ⅱ期12例,Ⅲ期27例。有淋巴結轉移者69例,無淋巴結轉移者73例。

1.1.2主要試劑與設備 兔抗人Shh單克隆抗體試劑盒及DAB染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);0.01 ml Citrate檸檬酸鹽緩沖液、0.01 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)(北京中杉金橋生物技術有限公司);研究級顯微鏡(日本OLYMPUS公司);生物組織全自動脫水機;石蠟包埋機、石蠟切片機(德國LEICA公司)。

1.2 方法

按試劑盒說明書操作。用已知Shh陽性脊髓神經組織作陽性對照,用PBS代替一抗作為陰性對照。在400倍光學顯微鏡下,通過攝像頭將標本組織免疫組織化學染色切片圖像采集。

1.3 染色結果判斷標準

兩名有經驗病理醫師根據Alakus的評分方法[2],分別對組織切片染色情況進行評分。細胞內出現棕褐色顆粒者為陽性細胞。至少隨機計數5個高倍視野(×400),免疫組織化學染色的強度和著色上皮細胞的比例都被考慮在內,將每張切片染色強度分為3級:1(弱染),2(中度),和3(強染)。而染色比例是根據陽性染色上皮細胞所占全部上皮細胞的比例來劃分為:0分,陰性;1分,陽性率≤30%;2分,陽性率30%-70%;3分,陽性率≥70%,評分≥1分即為陽性。

1.4 統計學處理

所有數據應用SPSS13.0統計軟件進行統計分析,采用 χ2檢驗進行顯著性分析,以P＜0.05為有統計學意義,P＜0.01為有十分顯著的統計學意義,P＞0.05為無統計學意義。

2 結果

2.1Shh在甲狀腺乳頭狀癌及癌旁甲狀腺組織中的表達情況PTC組織和其對應的癌旁甲狀腺組織中Shh均有不同程度的表達。Shh陽性染色定位于細胞膜與細胞質中,在組織中著色深淺不一,呈灶性或彌漫分布,癌細胞核及間質細胞表達量極少,PTC組織染色強度高于癌旁甲狀腺組織(圖1)。PTC組織中 Shh陽性表達率(64.1%)高于癌旁組織(16.9%),P＜0.01(表1)。

表1 Shh在甲狀腺乳頭狀癌中表達

圖1 Shh在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(20×)

2.2Shh表達與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的關系PTC組織中Shh蛋白的表達在患者性別及年齡的差異無統計學意義(P＞0.05)。而與腫瘤的TNM分期有關(P＜0.01)。Shh蛋白在腫瘤直徑≥1 cm的表達陽性率為79.2%,直徑＜1 cm的表達陽性率為56.4%,差異具有統計學意義(P＜0.01)。Shh蛋白在有淋巴結轉移的PTC組織中和無淋巴結轉移的PTC組織中的表達陽性率分別為72.5%和56.2%,差異有統計學意義,P＜0.05(表2)。

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌最常見的病理類型,其發病機制尚未闡明。細胞信號轉導機制的研究進入腫瘤研究領域,為腫瘤的診斷和治療提供了新的途徑。已發現BRAF/ERK-MAPK[3],SPH-1[4]等信號轉導路徑與PTC的發生發展及調控密切相關。近期研究,Shh信號通路參與腫瘤的浸潤轉移及腫瘤細胞分化的調控過程[5],探索Shh信號通路的表達變化規律、闡明其作用機制已逐漸成為國內外研究的熱點。Shh蛋白屬于分泌型信號蛋白,作為Shh信號傳導通路級聯反應的啟動信號。人類Shh基因定位于7號染色體長臂遠端(7q36),它編碼生成Shh前體蛋白,合成后自身水解為C-片段和N-片段,N-片段的C-末端與膽固醇結合后形成活性空間結構。其中N-末端信號肽具有典型分泌蛋白功能,不僅與多種細胞間相互作用有關,且與在胚胎發育中起著重要的作用,控制著細胞的“命運”和增殖。Shh蛋白是Shh信號通路的關鍵分子,分析中發現Shh信號通路包括Hh蛋白家族,Hh蛋白受體:PTCH蛋白或Patched/Smoothened(SMO)蛋白復合物,Glioma(Gli)蛋白家族等成員。通常情況下,在沒有Shh存在時,PTCH與SMO結合,從而對下游的傳導通路起抑制作用;在Shh作用下,Shh和PTCH結合,從而解除了后者對SMO的抑制作用,處于激活狀態的SMO引起cos2和Fu過度磷酸化,導致復合物從微管上解離,Cli3的蛋白水解被抑制后以全長(Cli155)的形式進入細胞核,與其下游基因啟動子區處于結合狀態,調控下游靶基因的轉錄表達,并最終導致腫瘤的惡性生物學行為進展。目前已報道Shh于胃癌[6]、結直腸癌[7]、乳腺癌[8]等惡性腫瘤發生、分期及淋巴結轉移有關。最近,Nelson[9]研究顯示Shh在PTC中的表達高達85%,并指出Shh與其惡性程度密切相關,但具體影響機制及分期的關系尚不清楚。

表2 Shh的表達與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的關系

在本研究中,Shh蛋白在PTC及癌旁甲狀腺組織中均有表達,主要表達于細胞膜與細胞質中,符合其他研究報道。本組Shh蛋白在PTC組織中表達率(64.1%)與Nelson報道的Shh在PTC中的表達率(85%)有差距,不除外疾病在不同人種的差異,但明顯高于在癌旁甲狀腺組織中的表達率(16.9%),表明PTC的發生、發展可能與Shh的過度表達有關。Shh蛋白在PTC腫瘤直徑≥1 cm和直徑＜1 cm的表達陽性率分別為79.2%和56.4%,有顯著統計學意義(P＜0.01),這表明Shh蛋白表達與PTC的生長、增殖和侵襲密切相關。在有淋巴結轉移患者癌組織中表達陽性率上升(72.5%),表明PTC的轉移可能與Shh的高表達有關。本組TNM分期Ⅱ、Ⅲ期病例中,Shh的表達陽性率高達82.1%,Ⅰ期表達陽性率為57.3%,有顯著統計學意義(P＜0.01)。

在本研究提示:Shh蛋白的過度表達可能是誘導PTC發生、發展的眾多原因之一,可能參與了PTC侵襲和轉移的調控。Shh信號通路的主要配體Shh蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中表達升高,并與腫瘤發生、分期及淋巴結轉移有關,提示Shh信號通路的異常激活在甲狀腺乳頭狀癌中發揮一定的作用,Shh蛋白為甲狀腺乳頭狀癌預后判斷指標及潛在的治療靶點,其機制有待進行廣泛、深入的研究。

[1]Woodruff SL,Arowolo OA,Akute OO,et al.Global variation in the pattern of differentiated thyroid cancer[J].Am J Surg,2010,200(4):462.

[2]Alakus H,Grass G,Hennecken JK,et al.Clinic pathological significance of MMP-2 and its specific inhibitor TIMP-2 in gastric cancer[J].Histol Histopathol,2008,23(8):917.

[3]Namba H,Nakashima M,Hayashida N,et al.Clinical implication of hot spot BRAF mutation,V599E,in papillary thyroid cancers[J].J Clin Endocrinol Metab,2003,88(9):4393.

[4]孫 輝,范曉迪,付言濤,等.SHP-1在甲狀腺癌組織中的表達及其臨床意義[J].中國實驗診斷學,2010,14(6):861.

[5]Williams Z,Tse V,Hou L,et al.Sonic hedgehog promotes proliferation and tyrosine hydroxylase induction of postnatal sympathetic cells in vitro[J].NeuroReport,2000,11(15):3315.

[6]Ohta M,Tateishi K,Kanai F,et al.p53-Independent negative regulation of p21/cyclin-dependent kinase-interaeting protein 1 by the Sonic hedgehogglioma-associated oncogene 1 pathway in gastric carcinoma cells[J].Cancer Res,2005,65(23):10822.

[7]Lees CW,Satsanqi J.Hedgehog,paneth cells,and colon cancer:a cautionary note for the use of systemic agonists/antagonists[J].Gastroenterology,2006,131(5):1657.

[8]Kubo M,Nakamura M,Tasaki A,et al.Hedgehog signaling pathway is a new therapeutic target for patients with breast cancer[J].CancerRes,2004,64(17):6071.

[9]Nelson KK,Gattuso P,Xu X,et al.Expression of the Sonic Hedgehog pathway molecules in synchronous follicular adenoma and papillary carcinoma of the thyroid gland in predicting malignancy[J].Central Surgical Association,2010,148(4):654.