缺氧誘導因子(HIF-1)的結構、調節與靶基因研究進展

邢英琦,徐 靜,李 琳,江新梅

(吉林大學第一醫院神經內科,吉林長春130021)

O2對于所有微生物的生存至關重要,是維持細胞內能量平衡的有氧代謝必不可少的物質。缺氧,是指O2水平低于正常的狀態,可出現于各種生理情況(胚胎發育、適應高海拔、傷口的愈合)與病理情況下(缺血性疾病和癌癥)。缺氧是一系列神經疾病(包括卒中、脊髓損傷和外傷性腦損傷)的中心因素,為了適應缺氧,微生物出現一系列系統性和局部性的改變以維持O2的平衡,減低缺氧的影響。系統性的改變是增加體內血流量以增加氧的運輸;局部性改變主要是血管再生;在細胞水平,最顯著的適應缺氧的反應是減少氧化磷酸化,增加糖酵解,以增加ATP的產量;在分子水平,主要的調節細胞對缺氧反應的調控者是缺氧誘導因子(HIF-1)。

1 HIF-1的結構

HIF-1是一種隨著細胞內氧濃度變化而調節基因表達的轉錄激活因子,是一個異二聚體,由氧調節亞單位HIF-1α(120 kDa)和結構亞單位91-94kDa HIF-1β,也稱作芳香烴受體核轉運蛋白或ARNT)組成。HIF-1α和HIF-lβ均為基本螺旋-環-螺線(bHLH)轉錄因子家族中的成員,并具有Per-ARNTSim(PAS)結構域。PAS結構域含有50多個氨基酸重復序列,由His-X-X-Asp基本序列構成。bHLH和 PAS結構域介導DNA的結合能力并和二聚化作用有關。α亞單位上其他結構域包括一個獨特的O2-依賴降解結構域(ODDD),這是正常氧分壓下HIF-1降解所必須的結構;還包括兩個反式激活結構域(transaction domain,TAD),主要參與轉錄激活作用;還包括N-末端活性域(NAD)和C-末端活性域(CAD)。

2 HIF-1的調節

在體內HIF-1的活性調節主要有4個方面,即HIF-1 mRNA的表達水平調節;HIF-1蛋白水平的調節;HIF-1二聚化和DNA結合活性的調節;HIF-1轉錄活性的調節。鐵離子螯合劑、鈷、鎳等金屬及部分抗氧化劑均能使HIF-1表達增加,但低氧是最主要的生理性HIF-1表達調節因子。

在正常氧濃度條件下,細胞內HIF-1α不穩定,半衰期不到5分鐘,很快通過氧依賴降解結構域介導的泛素蛋白酶體降解。在低氧情況下,HIF-1α穩定性增加,轉移到細胞核,與HIF-1β亞單位結合成二聚體HIF-1,HIF-1再與目的基因缺氧反應元件(HRG)結合從而激活轉錄過程。受HIF-1α調控的基因稱為HIF-1α的靶基因,這些靶基因的啟動子或增強子內含有一個或多個缺氧反應元件(HRE),其典型的核苷酸序列為5’-TACGTG-3’,是HIF-1的DNA 結合位點,活化的 HIF-1與之結合,形成HIF-1、p300/CBP環腺苷酸反應元件結合蛋白(CREB),以及其他轉錄因子的起始復合物,從而啟動靶基因的轉錄[1]。

2.1 HIF-1α穩定的調節

①PHDs:HIF-α的量由氧依賴性和氧獨立性機制調節。一方面,缺氧時α亞單位持續的轉錄和翻譯,但是另一方面要求隨時移走HIF-α。在有氧存在時,α亞單位被羥基化,之后迅速降解所以水平很低。激發羥基化作用的酶叫做HIF-脯氨酰4-羥化酶(PHDs)。PHDs包括 3個成員:PHD1、PHD2、PHD3,三者具有相近的催化域,屬于2-丙戊二酸(2OG)依賴加氧酶家族。PHD1、2和 3 C-末端催化區相同,但是N-末端序列不同。PHD1與HIF-1α有最高的特異活性,主要在細胞核里,而PHD2和PHD3主要在細胞漿里。為了保持活性,這些酶要求有氧和2OG作為共同反應物,Fe2+和抗壞血酸作為輔因子[2,3]。PHDs羥基化人類HIF-1α分子的脯氨酸亞基(pro-564或pro-402),之后羥基化的HIF-1α可以結合到Von Hippel-Lindau蛋白(pVHL)-E3泛素連接酶復合物上。PHDs是調節HIF-α的關鍵酶。

②pVHL:羥基化的脯氨酸亞基能使HIF-1被pVHL特異的識別[4,5]。VHL蛋白,與延伸因子B、延伸因子C、Cul2形成E3泛素連接酶的復合體,主要在細胞水平調節HIF-1α[6]。VHL是一個腫瘤抑制基因,本身沒有催化活性。然而它在HIF系統的調節及抑制腫瘤進展方面扮演重要的角色。pVHL有兩個亞結構域,α和β,分別與延伸因子 C及HIF-α結合[7]。染色體中間缺失分析表明pVHL與HIF-1α氧依賴降解域(ODD)相互作用[7-10]。

③泛素連接酶和蛋白酶體:羥基化的HIF-1α與pVHL結合,繼之泛素化。E2泛素連接酶UbcH5需要 K532、K538和K547受體以使VHL-介導的HIF-1α泛素化。之后,泛素化的HIF-1α轉移位置,在26S蛋白酶體內降解[6]。

④轉錄后修飾:除了羥基化,其他轉錄后修飾也影響HIF-1α的穩定性。HIF-1α轉移到核內后的調整(主要是磷酸化)有助于HIF-1的穩定和轉錄活性。最近研究發現,在缺氧時誘導一種蛋白名為“含有RWD sumoylation增強子”,增強低氧時HIF-1α的SUMO蛋白質修飾化,促進其穩定和轉錄活性[11]。

2.2 HIF-1α轉錄活性的調節

①FIH-1:為了實現其轉錄活性,HIF復合物需要結合到靶基因的HRE調節區。HIF-1α有兩個活性域,協同起作用:位于中心區的NAD-與ODDD重疊,CAD-位于C-末端。CAD的功能主要依賴于轉錄共激活子CBP/p300,并且HIF-αCAD與CBP/p300相互作用的調節是控制HIF轉錄活性的第二個分子“開關”。正常氧供下,HIF-1阻滯因子(FIH-1)通過保守氨基酸序列YDCEVNV/AP上N803羥基化(HIF-2α的N847)結合到HIF-α的C末端,阻滯其與p300/CBP相互作用。門冬酰-羥化酶 FIH-1與 PHDs相似,也需要O2、Fe2+和 2OG 以保持活性。低氧時,阻滯了N803羥基化,允許CAD和CBP/p300上富有半胱氨酸/組氨酸區域1(CH1)相互作用。

②其他轉錄因子競爭性作用:除了通過門冬酰胺羥化控制能否與HIF-αCAD 結合,HIF-α CAD-CBP/p300相互作用可以被競爭性抑制。因為共激活子CBP/p300可與大量轉錄因子相互作用,他們結合的總量是有限的。比如CITED2(以前P35srj/Mrg1)以高親和力與p300/CBP CH1結合,競爭性抑制其他p300/CBP CH1依賴轉錄因子,包括HIF[12]。活化的P53也能與p300/CBP螯合阻滯HIF功能[13]。

③共刺激子SRC-1與轉錄介導因子2:SRC-1與轉錄介導因子2進一步增強HIF-1α轉活潛力,并與CBP/p300產生協同作用[14]。MAP激酶也調節HIF的轉錄活性,但是確切分子機制仍有爭議。p42/44和p38MAP激酶均能刺激HIF-α活性,不影響其穩定[15]。

表1 HIF-1靶基因

3 HIF-α家族其他成員

除了HIF-1α,HIF-α家族包括另外兩個成員,HIF-2α(也叫做內皮PAS區域蛋白-1,EPAS-1)和HIF-3α,后兩者有更嚴格的組織表達。與HIF-1α相近,低氧時HIF-2α上調,并通過與缺氧反應元件(HRG)結合激活轉錄。HIF-1α、HIF-2α蛋白只有48%相同處,但是二者都含有保守的氧降解域,均被脯氨酰4-羥化酶調節。越來越多的證據表明HIF-1α、HIF-2α可能有不同的功能[16]。近期的分子遺傳學研究證明HIF-2α是促紅細胞生成素的生理性調節子,HIF-2α突變引起家族性紅血球增多癥[17]。HIF-3α在調節性氧降解域(ODD)上與HIF-1α、HIF-2α有高度相似性,但是缺少HIF-1α、HIF-2αC-末端轉錄激活域。低氧時HIF-3α活性被上調,它與 HIF-1β形成二聚體,并與HRE核心序列相結合,但是有趣的是,在人的腎臟,HIF-3α作用似乎是抑制缺氧誘導HIF介導的基因表達,因此HIF-3α是缺氧誘導基因表達的副調節因子[18]。

4 HIF-1靶基因

估計全部HIF靶基因200種-全部人類基因的1-5%,盡管并非全部直接由HREs調節,其它轉錄因子也參與其中。HIF激活的轉錄因子DEC1和2、ETS-1也可誘導缺氧基因表達。缺氧時,常見的應激反應轉錄因子,比如AP-1、NF-κ B和Egr1也上調,盡管這些因子對輕度缺氧的敏感性和轉錄反應的持久性遠不如HIF-1。

目前已確認HIF途徑直接激活超過70種基因,見表4.1。HIF誘導的蛋白表達主要幫助缺氧細胞的代謝和生存需要。功能包括血管再生、紅血球生成、凋亡、細胞分化/生存、糖代謝、PH值調節和鐵代謝。有趣的是,HIF激活的基因中即有編碼前凋亡蛋白的基因NIP3、BNIP3、Noxa,又有編碼抗凋亡蛋白的基因Mcl-1,這提示前凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的比值不同可能導致細胞對于缺氧有不同的反應。

結束語:HIF-1是一個重要的轉錄調控因子,在神經系統疾病中扮演重要的角色,因此對HIF-l結構、調控和靶基因的深入研究,必將為今后的臨床治療提供新的思路和方法。

[1]Sharp FR,BernaudinM.Hif1 and oxygen sensing in the brain[J].Nat Rev Neurosci,2004,5(6):437.

[2]Bruick RK,McKnight SL.A conserved family of prolyl-4-hydroxylases that modify hif[J].Science,2001,294(5545):1337.

[3]Epstein AC,Gleadle JM,McNeill LA,et al.Elegans egl-9 and mammalian homologs define a family of dioxygenases that regulate hif by prolyl hydroxylation[J].Cell,2001,107(1):43.

[4]Ivan M,Kondo K,Yang H,Kim W,et al.Hifalpha targeted forvhl-mediated destruction by proline hydroxylation:Implications for o2 sensing[J].Science,2001,292(5516):464.

[5]Jaakkola P,Mole DR,Tian YM,et al.Targeting of hif-alpha to the von hippel-lindau ubiquitylation complex by o2-regulated prolyl hydroxylation[J].Science,2001,292(5516):468.

[6]Maxwell PH,Wiesener MS,Chang GW,et al.The tumour suppressor protein vhl targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis[J].Nature,1999,399(6733):271.

[7]Ohh M,Park CW,IvanM,et al.Ubiquitination of hypoxia-inducible factor requires direct binding to the beta-domain of the von hippel-lindau protein[J].Nat Cell Biol,2000;2(7):423-427.

[8]Tanimoto K,Makino Y,Pereira T,et al.Mechanism of regulation of the hypoxia-inducible factor-1 alpha by the von hippel-lindau tumor suppressor protein[J].Embo J,2000,19(16):4298.

[9]Cockman ME,Masson N,Mole DR,et al.Hypoxia inducible factor-alpha binding and ubiquitylation by the von hippel-lindau tumor suppressor protein[J].J Biol Chem,2000,275(33):25733.

[10]Kamura T,Sato S,Iwai K,et al.Activation of hif1alpha ubiquitination by a reconstituted von hippel-lindau(vhl)tumor suppressor complex[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2000,97(19):10430.

[11]Carbia-Nagashima A,Gerez J,Perez-Castro C,et al,a small rwd-containing protein,enhances sumo conjugation and stabilizes hif-1alpha during hypoxia[J].Cell,2007,131(2):309.

[12]Bhattacharya S,MichelsCL,Leung MK,et al.Functional role of p35srj,a novel p300/cbp binding protein,during transactivation by hif-1[J].Genes Dev,1999,13(1):64.

[13]Blagosklonny MV,An WG,Romanova LY,et al.P53 inhibits hypoxia-inducible factor-stimulated transcription[J].J Biol Chem,1998,273(20):11995.

[14]Carrero P,Okamoto K,Coumailleau P,et al.Redox-regulated recruitment of the transcriptional coactivators creb-binding protein and src-1 to hypoxia-inducible factor 1alpha[J].Mol Cell Biol,2000,20(1):402.

[15]Conrad PW,Freeman TL,Beitner-Johnson D,et al.Epas1 trans-activation during hypoxia requires p42/p44 mapk[J].J Biol Chem,1999,274(47):33709.

[16]Sowter HM,Raval RR,Moore JW,et al.Predominant role of hypoxia-inducible transcription factor(hif)-1alpha versus hif-2alpha in regulation of the transcriptional response to hypoxia[J].Cancer Res,2003,63(19):6130.

[17]Percy MJ,Furlow PW,Lucas GS,et al.A gain-of-function mutation in the hif2a gene in familial erythrocytosis[J].N Engl J Med,2008,358(2):162.

[18]Hara S,Hamada J,Kobayashi C,et al.Expression and characterization of hypoxia-inducible factor(hif)-3alpha in human kidney:Suppression of hif-mediated gene expression by hif-3alpha[J].Biochem Biophys Res Commun,2001,287(4):808.