FHIT蛋白及mRNA在食管癌組織中的表達及意義

張德慶,陳東育,宋兆峰

(泰安市中心醫院 1.檢驗科;2.風濕免疫科;3.心血管內科,山東 泰安271000)

脆性組氨酸三聯體(fragi1ehistidinetriad,FHIT)基因是一種抑癌基因,與多種惡性腫瘤的發生密切相關。人們對其深入探討,發現該蛋白在多種腫瘤發生過程中發生廣泛的缺失和失活[1、2],在消化道腫瘤亦發現FHIT基因表達異常[3]。本文采用免疫組化和RT-PCR技術檢測食管癌及相應癌旁組織的FHIT蛋白和mRNA表達情況,從而探討FHIT與食管癌發生、發展的關系,以及在食管癌的診斷、治療以及預后判斷等方面的意義。

1 材料和方法

1.1 材料

收集我院腫瘤外科自2006年4月至2007年1月收治的50例食管癌患者的食管癌組織及相應癌旁組織,同期從我院內鏡室收集30例正常食管組織。所有組織標本均經病理檢查證實,臨床資料完整。50例食管癌均為食管鱗癌,其中男性31例,女性19例,年齡35-75歲,平均年齡53歲。依據1987年頒發的國際統一的食管癌TNM分期標準,TNM分期:Ⅰ期8例,Ⅱ期10例,Ⅲ期19例,Ⅳ期13例。所有患者術前均未進行化療及放療。

1.2 方法

1.2.1RT-PCR 將手術切取凍存的食管癌組織及相應癌旁組織制備成懸液,總RNA提取按Trizol試劑盒一步法提取。按試劑盒(試劑盒均為寶生物工程有限公司合成提供)要求的條件合成cDNA,所得逆轉錄產物用于PCR擴增。PCR反應條件:94℃2 min預變性,94℃變性40 sec,55℃退火40 sec,72℃延伸40 sec,共36個循環,72℃延伸7 min。基因引物序列及擴增片段見表1。

表1 FHIT基因引物序列及擴增片段

1.2.2免疫組化 采用SP免疫組化檢測法,抗FHIT多克隆抗體(一抗)和免疫組化染色超敏試劑盒(北京中山試劑公司)。以胞質內出現棕色顆粒為陽性,并根據陽性細胞數及反應強度制定如下判斷標準。按染色強度打分:3分為深棕色,2分為淺棕色,1分為淺黃色,0分為不染色。按陽性細胞所占百分比計分:0分為無陽性細胞,1分為陽性細胞數≤10%,2分為陽性細胞數11%-50%,3分為陽性細胞數51%-75%,4分為陽性細胞數＞75%。染色強度與陽性細胞百分比的乘積位于0-2分為缺失表達,2-3分為弱表達,＞3分的為正常表達。

1.3 統計分析方法

本實驗采用SPSS13.0統計軟件進行統計學分析,計數資料采用卡方檢驗,以P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR結果

2.1.1部分食管癌組織中FHIT基因PCR產物電泳結果見圖1。

2.1.2FHIT mRNA的檢測結果見表2。

表2 不同類型組織中FHIT mRNA的缺失率

癌組織中FHIT mRNA缺失率82%,癌旁組織中22%,正常組織中16.7%,癌組織中FHIT表達與其他兩種組織比較均有顯著性差異(P＜0.001)。

2.2 FHIT蛋白在不同組織中的表達情況。

2.2.1FHIT蛋白的免疫組化結果見圖2。

圖1 FHIT基因PCR產物電泳結果

圖2 FHIT蛋白的正常表達

FHIT蛋白在正常食管組織呈正常表達(如圖2),正常上皮細胞排列規則整齊,胞質染色均勻清晰;癌細胞陽性染色區細胞排列雜亂,染色不均一,陽性細胞數少或消失。

2.2.2不同類型組織中FHIT蛋白的檢測結果見表3。

表3 不同類型組織中FHIT蛋白表達的百分率

癌組織中FHIT蛋白缺失率66%,癌旁組織中18%,正常組織中6.7%,癌組織中FHIT蛋白與其他兩種組織比較均有顯著性差異(P＜0.001)。

2.3 不同病理類型的癌組織中FHIT基因及蛋白檢測結果 見表4。

表4 不同病理類型癌組織中FHIT蛋白和mRNA的表達

3 討論

食管癌和其他惡性腫瘤一樣,已被公認為一種基因性疾病,多種癌基因和抑癌基因協同作用而導致食管癌的發生發展。隨著分子生物學的快速發展,抑癌基因在食管癌中的作用已越來越受到人們的重視。研究發現,絕大多數腫瘤中,FHIT表達出現頻繁降低或丟失,腫瘤的發生與FHIT基因轉錄缺失有關,提示FHIT基因為多種腫瘤的候選抑制基因[4]。

本研究中我們檢測了FHIT蛋白和mRNA在三種組織中的表達,結果表明FHIT蛋白和mRNA在癌組織中的表達是一個漸進的過程,隨著癌前細胞向癌細胞的轉化,FHIT的兩種表達逐漸減低。因此,FHIT基因表達的缺失提示組織學上正常的組織存在癌變的可能,具有早期診斷價值。另外,FHIT在癌組織中缺失率明顯高于癌旁組織和正常組織,它表明在食管癌發生發展過程中FHIT基因的表達缺失或減弱可能降低了其抑癌基因的功能而增加了食管癌的易感性。由表4的結果可以看到FHIT在癌組織中的陽性表達率隨著病理分期越晚,FHIT陽性表達率呈下調趨勢;有淋巴結轉移的癌組織中FHIT陽性表達率顯著低于無淋巴結轉移的組織提示FHIT陽性表達與淋巴結轉移呈負相關;而在高分化、中分化、低分化鱗癌組織中,FHIT基因表達的缺失率隨分化程度越低,呈逐漸增高趨勢,但兩兩比較無顯著性差異(P＞0.05),提示食管癌組織中FHIT基因的陽性表達與癌組織分化程度可能無關。

目前,提高食管癌5年生存率的關鍵仍然是早期診斷,而早期診斷的關鍵是能否找到一種靈敏度高、特異性強的診斷方法,針對各種異常基因的檢測為我們開辟了新的思路。郭曉青[5]等檢測血漿中FHIT基因的甲基化發現,患者的腫瘤中表現出了血漿中FHIT基因的甲基化,病理分級為Ⅰ級及腫瘤長徑小于2cm的腫瘤患者被檢測出血漿DNA中FHIT基因的異常,表明血液中DNA的FHIT基因的檢測,有望成為食管癌早期診斷的一個較好方法。Askari等[6]開發出一種利用高效熒光檢測技術同時檢測FHIT DNA及蛋白表達的多功能生物芯片,它具有靈敏性、選擇性和直接性等優點。隨著基因異常與食管癌發生、發展二者之間相關關系的確定,人們已開始探討針對基因異常的若干實驗性治療方法在食管癌治療中的意義及價值。

綜上所述,FHIT蛋白和mRNA的表達缺失和下調與食管癌的發生、發展密切相關,兩種指標的同時檢測為食管癌早期診斷和預后判斷提供了依據。但是作為與食管癌發生相關的候選抑癌基因,FHIT基因在食管癌的診斷、治療、預后等方面的價值還有待于更深入的研究。

[1]Andachi H,Yashima K,Koda M,et al.Reduced FHIT expression is associated with mismatch repair deficiency in human advanced colorectal carcinoma[J].Br Cancer,2002,87:441.

[2]Noguchi T,Takeno S,Kirura Y,et al.FHIT expression and hyper methylation in esophageal squamous cell carcinoma[J].Int Mof Med,2003,11:441.

[3]Stec-M ichalska K,Antoszczyk S,Klupinska G,et al.Loss of FHIT expression in gastric mucosa of patientswith family histories of gastric cancer and helicobacter pylorinfection[J].World J Gastroenterol,2005,11:17.

[4]Sorio C,Baron A,Orlandini S,et al.The FHIT gene is expressed in pancreatic ductular cells and is altered in pancreatic cancers[J].Cancer Res,1999,59(6):1308.

[5]郭曉青,王士杰,叢慶文.血漿p16和FHJT基因甲基化在食管癌及癌前病變檢測的臨床意義[J].腫瘤,2006,26(9):832.

[6]AskariMD,MillerGH,Vo Dinh T,et al.Simultaneous detection of the tumor suppressor FH IT gene and protein using themultifunctional biochip[J].Camcer Detect Prev,2002,26:331.