血管緊張素Ⅱ對腎小球系膜細胞MCP-1表達的影響

邢 燕,孫致連,董崇周,葉山東

(安徽醫科大學附屬省立醫院·安徽省立醫院內分泌科,安徽合肥230001)

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAS)活化參與了多器官損傷(包括糖尿病腎小球硬化),其對腎臟的損害可通過腎小球血流動力學和非血流動力學兩方面發揮作用,其中血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)起了重要介導作用[1]。近來研究證實慢性低度炎癥反應參與腎小球硬化,尤其是糖尿病腎小球硬化的發生和發展[2]。單核巨噬細胞趨化蛋白-1(MCP-1)作為一種重要的炎癥趨化刺激因子,主要趨化單核細胞和T淋巴細胞,誘導單核細胞、內皮細胞表達黏附分子,使各種炎性細胞尤其是單核細胞向病變部位聚集,參與腎小球硬化的發生。

本試驗應用SD大鼠腎小球系膜細胞的細胞株,觀察AngⅡ對腎小球系膜細胞MCP-1 mRNA表達和蛋白合成的影響,探討AngⅡ參與腎小球硬化的炎性機制,為臨床應用血管緊張素轉化酶抑制劑或AngⅡ受體阻滯劑防治腎小球硬化提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 主要實驗試劑

小牛血清(杭州四季青公司);Trizol(美國Invitrogen公司);逆轉錄試劑盒(美國Promega公司);PCR試劑(大連寶生物公司);DEPC(美國Sigma公司);胰蛋白酶(美國Sigma公司);L-谷氨酰胺(美國Life Technologies公司);HEPES(華美生物工程公司);MCP-1 ELISA試劑盒(美國R&D公司);PCR所用引物(上海生工生物技術有限公司);血管緊張素Ⅱ(美國Sigma公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1實驗細胞 SD大鼠腎小球系膜細胞株(HBZY-1)購自中國典型培養物保藏中心。

1.2.2腎小球系膜細胞培養和標本收集 液氮罐取出凍存的細胞株快融復蘇后離心棄上清后接種于培養瓶中。培養液為含10%小牛血清、0.3 g/L L-谷氨酰胺、2.38 g/L HEPES的MEM培養基。培養瓶置于5%的CO2、37℃培養箱內培養,實驗用第5-7代。將系膜細胞以1.5×105接種到培養瓶中,當系膜細胞生長至80%融合,改含1%血清的培養基同步18 h后,記為0 h,按實驗分組,不同濃度AngⅡ(A1組:10-9mol/L;A2組:10-7mol/L;A3組:10-5mol/L)作用后48 h收集細胞上清液和系膜細胞,于-80℃冰箱凍存,以備統一檢測。10%小牛血清MEM(含糖5.6 mmol/L)為對照(C)組。每組均設6個樣本。

1.2.3系膜細胞MCP-1mRNA和上清液MCP-1蛋白測定 系膜細胞MCP-1mRNA測定:各組系膜細胞的總 RNA提取按Trizol說明書進行,取1 μ g總RNA配制逆轉錄反應體系,70℃5 min,37℃5 min,42℃60 min孵育經AMV逆轉錄酶及OlidT引物等條件下,逆轉錄合成cDNA,用特異性引物對逆轉錄產物進行半定量PCR。MCP-1引物序列為:上游引物為 5′-CAC CTG CTG CTA CTC ATT CAC T-3′,下游為 5′-GTT CTC TGT CAT ACT GGT CAC TTC-3′,目的片段長度為349 bp;反應條件:94℃變性60 s后,56℃退火60 s,72℃延伸60 s的熱循環,循環35次后,終末72℃延伸10 min,以GAPDH為內參照。取2.5 μ l PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色,紫外燈下照相,用UVI圖象分析處理系統進行灰度掃描。并以GAPDH校正作相對量分析,數值以MCP-1/GAPDH條帶光密度比值表示MCP-l mRNA產物的相對半定量值。

系膜細胞上清液中MCP-1測定采用ELISA法,按照MCP-1試劑盒說明書操作。根據不同濃度標準品測定的OD值繪制標準曲線,計算各樣品的濃度。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 不同濃度AngⅡ對系膜細胞MCP-1蛋白合成影響

與C 組比較,10-9、10-7、10-5mol/L AngⅡ作用于系膜細胞48 h后,各組上清液MCP-1濃度顯著增加(均 P＜0.01),A2、A3組與A1組比較,差異顯著(均P＜0.01),A2組上清液MCP-1濃度最高,A3組MCP-1濃度稍下降,但與A2組比較差異無顯著性。見表1。

2.2 不同濃度AngⅡ對系膜細胞MCP-1mRNA表達影響

與C 組比較,10-9、10-7、10-5mol/L AngⅡ作用于系膜細胞48h后,各組MCP-1mRNA表達均顯著增強(均 P＜0.01),A2、A3組與A1組比較,差異顯著(均P＜0.01),A2組MCP-1mRNA表達最高,A3組MCP-1RNA表達有所下降,但與A2組比較差異無顯著性。見表1和圖1。

表1 不同濃度 AngⅡ對系膜細胞MCP-1蛋白和 MCP-1mRNA表達的影響(s,n=6)

表1 不同濃度 AngⅡ對系膜細胞MCP-1蛋白和 MCP-1mRNA表達的影響(s,n=6)

注:與C組相比,*P＜0.01;與A1組相比,▲P＜0.01

序號 組別 樣本數 MCP-1(pg/ml)MCP-1mRNA/GAPDH

圖1 不同濃度AngⅡ對系膜細胞MCP-1mRNA的表達影響,H2O為只加水,C為對照組,A1為10-9 mol/L AngⅡ、A2為10-7mol/L AngⅡ、A3為10-5mol/L AngⅡ

3 討論

MCP-1屬于趨化因子CC家族中一種特異的單核/巨噬細胞趨化因子,其受體為趨化因子受體-2(CCR2)。正常腎組織中多種細胞如腎系膜細胞、小管上皮細胞、腎小球內皮細胞,成纖維細胞及浸潤的免疫細胞受刺激后均可合成和分泌MCP-1。MCP-1微量表達是正常腎臟生理功能所必須的,它可以趨化單核巨噬細胞在腎組織浸潤,清除Gly-Alb和氧化LDL(Ox-LDL),減輕組織損傷。本實驗結果顯示,腎小球系膜細胞可低度表達MCP-1,與文獻報道一致[3]。糖尿病情況下,腎組織過度表達的MCP-1,介導的單核/巨噬細胞在腎臟的聚集和活化,參與腎小球硬化(包括DN)的發生和發展。

研究[4]證實,糖尿病患者腎臟局部AngⅡ活性增高,腎小管周圍、腎臟間質中、髓質中AngⅡ水平高于循環中的水平,支持AngⅡ在腎臟局部合成。糖尿病腎臟局部AngⅡ活性增加促進腎小球硬化的發展,它包括改變腎小球血流動力學變化和非血流動力學兩方面的作用,其確切的機制尚不十分明確。AngⅡ所引發的非血流動力學效應及其與炎癥因子之間的關系正在闡明[5]。研究證實AngⅡ能維持并增強腎臟的微炎癥反應,發揮促炎癥作用,參與腎小球損傷的發生和發展。Lin L等報道血管緊張素受體拮抗劑坎地沙坦減少腎臟組織的AngⅡ的產生,減輕腎臟損傷和趨化因子MCP-1的增加[6]。本研究結果顯示AngⅡ能明顯增強體外培養的腎小球系膜細胞MCP-1 mRNA表達和蛋白合成,并且在一定范圍內隨AngⅡ濃度增加而表達增強,存在一定的濃度依賴性,10-7mol/L AngⅡ刺激系膜細胞MCP-1 mRNA表達和蛋白合成作用最強。而Pan Q等[7]報道Ang可誘導腎小球內皮細胞MCP-1的表達,可能是通過NADPH氧化酶依賴的NF-kappa信號通路介導。Gill PS報道AngⅡ主要通過激活NADPH氧化酶和增加線粒體內活性氧(ROS)來刺激細胞內ROS的生成,進而促進炎癥因子表達[8]。替米沙坦作為AT1受體阻斷劑,在系膜細胞可抑制終末糖基化產物誘導的MCP-1的表達,而這一作用可能是通過過氧化物增殖活化受體γ活化介導的終末糖基化產物受體的下調而完成的。提示終末糖基化產物系統與AngⅡ的病理生理聯系可能與糖尿病腎病的發病機制有關[9]。本研究未發現10-5mol/L的AngⅡ進一步促進系膜細胞MCP-1的表達和合成,可能因為AngⅡ與受體的結合具有特異性、飽和性、可逆性、競爭性以及與其受體數量下降和受體飽和度有關。

總之,本研究初步結果顯示AngⅡ可刺激大鼠腎小球系膜細胞表達和合成MCP-1,并具有一定的劑量依賴性,該結果為阻斷或抑制AngⅡ為靶點來防治腎小球硬化(包括糖尿病腎病)提供了一定的實驗依據,確切機制值得進一步探討。

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