腫瘤抑素抗腫瘤相關(guān)肽抑制卵巢癌的實驗研究

宋菁華,王 玫,李 斌

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院 婦產(chǎn)科,北京100029;2.中國人民解放軍302醫(yī)院 婦產(chǎn)科,北京100039)

腫瘤抑素是膠原蛋白Ⅳα 3鏈的非膠原區(qū),由Saus等在80年代作為肺-腎出血綜合征的自身抗原而被發(fā)現(xiàn)[1]。2000年,Kamphaus等發(fā)現(xiàn)其有2個不同的抗腫瘤活性區(qū)[2],其中之一是靠近C端的185-203位氨基酸組成的19肽,因其具有直接抑制腫瘤細(xì)胞生長、促進腫瘤細(xì)胞凋亡的作用受到人們的普遍關(guān)注[3]。有研究表明,19肽作為腫瘤抑素整體的一部分時,并不顯示其抗腫瘤細(xì)胞增殖的功能[4],且腫瘤抑素的分子質(zhì)量較大,本身含有肺-腎出血綜合征的自身抗原,限制了其應(yīng)用。本實驗通過基因工程技術(shù)獲得了分子質(zhì)量小、可溶性高、使用安全的腫瘤抑素19肽,建立人卵巢癌細(xì)胞SKOV3裸鼠移植瘤模型及腫瘤抑制實驗的研究,探索腫瘤抑素19肽抗腫瘤活性及其作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

人卵巢癌SKOV3細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物化學(xué)研究所;腫瘤抑素19肽由本室克隆、表達(dá)和純化后制備;BALB/c(nu/nu)裸鼠購自吉林大學(xué)第一醫(yī)院;RPMI1640培養(yǎng)基購自GIBCO BRL;胎牛血清購自清源生物公司;原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、SABC免疫組化染色試劑盒、AEC顯色試劑盒購自博士德生物工程有限公司;caspase 3一抗購自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1實驗動物模型制備 收獲對數(shù)生長期卵巢癌SKOV3細(xì)胞,含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸,調(diào)整為1×107個/ml,抽取細(xì)胞懸液500 μ l接種于裸鼠腋窩近肩胛下部皮下,形成一隆起皮丘。當(dāng)細(xì)胞接種成功的原代移植瘤長至直徑0.8-1.0 cm時,在無菌條件下頸椎脫臼法處死裸鼠,用無菌眼科剪鑷剝?nèi)∑は履[瘤,剪成直徑1-2 mm瘤組織塊接種至裸鼠皮下。接種過程在腫瘤離體后40-50 min內(nèi)完成。

1.2.2小鼠腫瘤抑制實驗的研究 于腫瘤塊植入皮下后第8天開始治療試驗,隨機分為兩組,每組6只裸鼠。腫瘤抑素19肽組:按5 mg/kg劑量給藥,尾靜脈注射19肽0.2 ml。對照組:尾靜脈注射無菌生理鹽水0.2 ml。隔天注射,共注射7次。每天觀察裸鼠活動情況、對外界刺激的反應(yīng)、飲食、體重及瘤體表面皮膚等的變化,用游標(biāo)卡尺測量腫瘤結(jié)節(jié)的最長徑(a)及最短徑(b),計算腫瘤體積(V=π ab2/6),求其平均值。給藥結(jié)束后觀察5天處死小鼠,完整剝離腫瘤,稱重,計算腫瘤生長抑制率(tumor inhibition ratio,TIR)=(1-給藥組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100%,進行t檢驗。部分腫瘤組織塊用4%多聚甲醛固定,用于病理學(xué)和免疫組織化學(xué)檢查。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠人卵巢癌皮下移植瘤模型的建立

鼠間瘤組織塊接種法的潛伏期為7-12天,鼠間傳代移植成功率為100%。裸鼠皮下瘤呈圓球型或橢球形或多分葉狀實體瘤,表面可見豐富皮下血管網(wǎng),腫塊表面有一層薄的包膜,與周圍組織邊界清晰。腫瘤淡黃或乳白色,質(zhì)地中,切面可見多個囊腔,有淡黃色稀薄囊液,囊壁不光滑,似有分葉狀乳頭。癌細(xì)胞生長活躍,呈多層排列,胞漿豐富,細(xì)胞核大小形狀不規(guī)則,核分裂相多見,呈不規(guī)則團塊狀排列,有不同程度的腺管狀結(jié)構(gòu)形成,伴有間質(zhì)浸潤,與人原發(fā)性癌組織一致。淋巴結(jié)及其他臟器均未見腫瘤轉(zhuǎn)移。結(jié)果表明成功的用SKOV3細(xì)胞株建立了人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型,為后續(xù)抗腫瘤試驗提供了實驗動物模型。

2.2 小鼠腫瘤抑制實驗

2.2.1藥物對裸鼠腫瘤細(xì)胞生長的抑制情況 所有裸鼠在接種卵巢癌細(xì)胞后一般狀況良好,體重自給藥開始后均有下降,但下降幅度均較小,總體趨勢一致,出現(xiàn)不同程度的行動遲緩,反應(yīng)遲鈍。體重?zé)o明顯的變化,組間比較P＞0.05,無統(tǒng)計學(xué)意義。試驗過程中各組均無動物自然死亡,腫瘤抑素19肽未見明顯毒副反應(yīng)。用藥后對照組與實驗組小鼠腫瘤繼續(xù)生長,但實驗組腫瘤體積較對照組腫瘤體積有明顯減小,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),見表1。實驗結(jié)束時,處死裸鼠,實驗組腫瘤明顯小于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),見表2。

表1 兩組裸鼠腫瘤體積的變化(cm3,s)

表1 兩組裸鼠腫瘤體積的變化(cm3,s)

*P＜0.05

組別時間(d)0 5 10 15 20 25 19肽 0.04 0.05±0.01 0.24±0.05* 0.61±0.1* 0.89±0.19* 1.17±0.31*生理鹽水 0.04 0.05±0.01 0.65±0.33 0.92±0.4 1.33±0.55 1.78±0.49

表2 兩組裸鼠皮下移植瘤抑瘤率的比較

2.2.2裸鼠腫瘤病理組織切片(×20)對照組卵巢癌細(xì)胞長勢良好,無壞死,血管豐富,數(shù)量較多。19肽組腫瘤組織出現(xiàn)大量壞死,血管數(shù)量較少,僅有一處視野可見新生血管。

2.2.3對人卵巢癌皮下移植瘤細(xì)胞凋亡的作用TUNEL染色是特異性檢測細(xì)胞凋亡的一種方法。細(xì)胞凋亡最終會導(dǎo)致DNA裂解,TUNEL通過標(biāo)記裂解的DNA 3′-OH末端而檢測凋亡。對照組偶爾可見個別細(xì)胞有熒光著色,實驗組可見較多凋亡細(xì)胞(圖1),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2.4對人卵巢癌皮下移植瘤細(xì)胞中caspase 3表達(dá)的影響 對照組裸鼠移植瘤組織中偶爾可見個別細(xì)胞有caspase 3蛋白的表達(dá),而19肽組裸鼠移植瘤組織中caspase 3蛋白的表達(dá)顯著增加,紅色顆粒明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),見圖2。

圖1 兩組皮下移植瘤細(xì)胞凋亡的比較(700倍)

圖2 兩組皮下移植瘤細(xì)胞中caspase3的表達(dá)情況(40×)

3 討論

卵巢惡性腫瘤是女性生殖器官常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率占女性生殖器惡性腫瘤的第三位,但病死率居首位[5]。目前我國對卵巢惡性腫瘤缺乏有效的早期診斷手段,因此大多數(shù)卵巢惡性腫瘤就診時,已屬中晚期,5年存活率很低。為此,建立新的、有效的卵巢癌防治措施勢在必行。腫瘤抑素是最新發(fā)現(xiàn)的基底膜來源的腫瘤血管生成抑制因子,本實驗通過基因工程技術(shù)獲得了腫瘤抑素19肽,應(yīng)用移植性卵巢癌裸鼠作為研究對象,進一步研究了腫瘤抑素19肽的抗腫瘤活性及其作用機制,為卵巢瘤的臨床治療提供了新的思路。

腫瘤細(xì)胞凋亡受到抑制,存活期延長,死亡率下降,細(xì)胞數(shù)目增加,表現(xiàn)出失控性生長,原因之一就是細(xì)胞周期調(diào)控機制的破壞[6]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是細(xì)胞喪失自發(fā)凋亡反應(yīng)能力的最終結(jié)果,細(xì)胞凋亡途徑受阻或凋亡功能喪失己成為腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素[7],因此通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的基本策略之一。我們采用TUNEL法從生化的角度觀察了兩組皮下移植瘤細(xì)胞的凋亡情況。研究結(jié)果表明,19肽組的凋亡指數(shù)顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

細(xì)胞凋亡是一個非常復(fù)雜的生理和病理過程,機體內(nèi)外多種因素均可影響細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Caspase是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine aspartatespecific proteinase)的簡稱,為一大類以半胱氨酸為活性中心的蛋白水解酶,與真核細(xì)胞凋亡密切相關(guān),還參與了細(xì)胞因子的成熟、細(xì)胞生長和分化[8]。研究表明caspases家族在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機制中起著關(guān)鍵作用,是多條凋亡通路的匯聚點,是執(zhí)行凋亡的最終途徑[9]。目前發(fā)現(xiàn)人類caspases家族至少有11種,其中激活的caspase 3能使許多細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞周期及DNA修復(fù)等相關(guān)的蛋白或激酶失活,從而使細(xì)胞凋亡,是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者。本研究表明,19肽組的caspase 3的表達(dá)水平顯著高于生理鹽水對照組,這可能是19肽抑制腫瘤生長和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機制之一。

綜上所述,腫瘤抑素185-203位氨基酸組成的19肽在裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型體內(nèi)可以有效地抑制腫瘤細(xì)胞生長,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,為卵巢癌的臨床治療提供了新的思路和依據(jù)。腫瘤抑素的抗腫瘤作用仍在研究當(dāng)中,期望本研究能為進一步探索腫瘤抑素19肽的抗腫瘤作用奠定基礎(chǔ)。

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