FTY720對體外培養MCF-7細胞增殖及凋亡影響的研究

張淑芳,劉大程,孫吉鳳,臺桂香*

(1.長春醫學高等專科學校生化教研室,吉林長春130031;2.吉林大學白求恩醫學院免疫學教研室,吉林長春130021)

FTY720是冬蟲夏草代謝產物ISP-l經化學修飾而得到的一種新的化合物[1]。它作為一種新型免疫抑制劑被研究的較多,而對FTY720抑制腫瘤細胞增殖、促進細胞凋亡的研究,國內罕見報道。因此,我們選擇了以人乳腺癌(MCF-7)細胞為研究對象,初步探討FTY720對體外培養腫瘤細胞增殖抑制及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人乳腺癌(MCF-7)細胞本研究室保存。

1.1.2藥品與試劑 RPMI1640培養基購于Gibco/BRL公司。四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、小牛血清及碘化丙啶(PI)、瑞士-姬姆薩染色液購于北京鼎國生物技術公司。FTY720購自美國SIGMA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養 人乳腺癌(MCF-7)細胞株接種于含10%小牛血清、100 U/ml青霉素及100 U/ml鏈霉素的RPMI1640培養液中,置37℃、5%CO2孵箱中培養,24-48 h換液、傳代1次。

1.2.2MTT法檢測細胞增殖抑制率 收集對數生長期的MCF-7細胞并調細胞濃度至5×104個/ml接種于96孔培養板,每孔加 100 μ l細胞懸液,置于37℃、5%CO2培養箱內培養24 h后給藥。實驗設藥物處理組、陰性對照組、空白對照:藥物處理組每孔加入100 μ l FTY720溶液使其終濃度分別達到400、800、1 600、3 200、6 400 ng/ml,陰性對照組不加藥物,空白對照不加細胞只加RMPI1640培養液,各濃度組均設3復孔,37℃、5%CO2培養箱培養48 h,每孔加入 5 mg/ml MTT 10 μ l,繼續孵育 4 h 后,棄上清液,加入150 μ l DMSO,輕輕振蕩 10分鐘 ,待藍紫色結晶物完全溶解,于570 nm波長處在酶標儀上測吸光度值(OD值),求平均值,計算藥物對細胞生長增殖的抑制率。細胞生長抑制率=(1-藥物處理組OD值/陰性對照組OD值)×100%。

1.2.3瑞士-姬姆薩染色觀察細胞形態 取對數生長期細胞接種于鋪有蓋玻片的6孔培養板,加入FTY720,同時設陰性對照,藥物終濃度分別為800、1 600、3 200 ng/ml,作用 48 h,取片風干,滴加無水乙醇待風干,加瑞士-姬姆薩染液染色30秒,PBS作用2分鐘,洗去染液,無水乙醇固定,晾干、封片,鏡檢拍照。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡 取對數生長期細胞給藥,同時設陰性對照,FTY720終濃度分別為800、1 600、3 200 ng/ml,作用細胞48 h 后收集細胞,調整細胞濃度為 1×106個/ml。以1 000 r/min離心5 min棄上清,PBS洗滌2次,70%乙醇4℃固定過夜 ,以 50 μ g/ml的 PI37℃避光染色30 min,用流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡。

1.3 統計學方法

用SPSS統計軟件對結果進行分析,實驗數據取均數±標準差表示,采用方差分析和t檢驗。

2 結果

2.1 細胞增殖抑制率

MTT 法檢測顯示,濃度為 400、800、1 600、3 200、6 400 ng/ml的FTY720作用 48小時后,對MCF-7細胞的增殖均有一定程度抑制作用,抑制率分別為12.2%、23.8%、26.9%、36.3%、62.0%,呈濃度依賴性。與400 ng/ml組相比,1 600 ng/ml和6 400 ng/ml組P＜0.05,組間有顯著差異。(表1)

表1 FTY-720對體外培養MCF-7細胞的抑制作用(s)

表1 FTY-720對體外培養MCF-7細胞的抑制作用(s)

注:與 400 ng/ml組相比,*P＜0.05

藥物濃度 48小時抑制率(%)400 ng/ml 12.2±0.022 800 ng/ml 23.8±0.058

2.2 細胞形態

鏡下可見FTY720作用48小時的MCF-7細胞染色質濃縮、分割成塊狀,細胞膜完整但胞漿出現發泡現象,大部分細胞發生凋亡。(圖1)

圖1 FTY-720對MCF-7細胞形態影響

2.3 細胞周期及凋亡

分別用800、1600、3200ng/ml的 FTY720 作用MCF-7細胞48 h,經流式細胞儀檢測分析顯示,與對照組相比,隨藥物濃度增加,實驗組處于G1期的細胞逐漸增多,S期細胞明顯減少(表2),表明FTY720可將其細胞周期阻滯于G1期;細胞凋亡率也較對照組明顯增加,P＜0.05(表2,圖2)。

表2 FTY-720對MCF-7細胞周期及凋亡的影響(s)

表2 FTY-720對MCF-7細胞周期及凋亡的影響(s)

注:與對照組相比,*P＜0.05

藥物濃度 G1期(%)S期(%)G2期(%)凋亡率(%)對照組 57.5±0.021 30.6±0.031 11.9±0.012 4.22±0.015 800 ng/ml 60.8±0.018 21.5±0.026 17.7±0.034 5.64±0.009*

圖2 FTY-720對MCF-7細胞周期及凋亡的影響

3 討論

惡性腫瘤嚴重威脅著人類的健康和生命,近些年,運用中草藥治療惡性腫瘤,越來越被廣大學者和患者接受,是治療惡性腫瘤的有效手段之一。臨床實驗證明,中草藥有較好抗腫瘤作用,無明顯毒副作用,不僅對化、放療起到減毒、增敏、增效的效應,而且能預防腫瘤的復發及轉移。FTY720,是將傳統中藥冬蟲夏草抽提物中的成分ISP-1進行結構改造而成的新物質,因由日本的Fujita教授(Taito公司)和Yoshitomi藥品公司共同研制成功而得名[1]。

目前,FTY720的抗腫瘤作用已引起研究者的關注。有實驗證實,FTY720能誘導HL-60、Jurkat、實體膀胱腫瘤細胞、人胰腺癌等多種腫瘤細胞系凋亡[2-4]。

本研究以人乳腺癌(MCF-7)細胞為研究對象,旨在初步探討不同濃度FTY720對體外培養腫瘤細胞增殖抑制及凋亡的影響。本實驗結果發現,FTY720濃度為6 400 ng/ml時,體外培養MCF-7細胞的增殖受到顯著抑制(P＜0.05),抑制作用基本呈劑量依賴性。在此實驗基礎上,我們進行了細胞形態觀察及細胞周期的檢測,將不同濃度FTY720作用48小時的MCF-7進行瑞士-吉姆薩染色后,與對照組相比,鏡下觀察可見明顯的凋亡細胞形態,實驗組細胞變小,胞漿中出現明顯發泡現象,胞膜完整,而且細胞染色質濃縮、分割成塊狀。流式細胞儀檢測結果顯示,隨著FTY720濃度增大,MCF-7細胞處于G1期的比例逐漸增多,S期細胞逐漸減少,細胞凋亡率也隨之增大,說明該腫瘤細胞DNA合成受到了抑制,表明FTY720可誘導MCF-7腫瘤發生凋亡,且這種作用存在劑量依賴性。

本研究結果顯示,一定濃度的中藥制劑FTY720可抑制體外培養MCF-7細胞的增殖,誘導該腫瘤細胞凋亡,這為進一步研究其抗腫瘤作用提供了一定的實驗依據,同時,預示著FTY720作為腫瘤治療藥物有著良好的應用前景。

[1]Fujita T,Inoue K,Yamamoto S,et al.A potent immunosupptessive activity found in Isaria sinclairii metabolite[J].J Antibiot,1994,47(2):208.

[2]Suzuki S,Li XK,Enosawa S,et al.A new immunosuppressant,FTY720,induces bcl-2-associated apoptotic cell death in human lymphocytes[J].Immunology,1996,89:518.

[3]Azuma H,Takahara S,Horie S,et al.Induction of apoptosis in human bladder cancer cells in vitro and in vivo caused by FTY720 treatment[J].J Urol,2003,169(60:2372.

[4]王 瑞,何景華.FTY720抑制人胰腺癌Miopac2細胞株增殖的研究[J].天津醫科大學學報,2008,14(4):445.