血管生成素-1對HCT-8細(xì)胞的作用及其可能機制的研究

張繼紅,溫春陽,于曉艷,李相軍,尹 麗,任立群*

(1.吉林大學(xué)藥學(xué)院,吉林 長春130021;2.北華大學(xué)附屬醫(yī)院;3.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)部)

近些年來,隨著分子生物學(xué)的發(fā)展及對大腸癌的機制研究的不斷深入,如何針對基因的靶向治療已成為熱點。Ang-1作為血管生成素(Ang)家族的一種,據(jù)國內(nèi)外文獻報道,主要是通過Ang-1/Tie-2信號系統(tǒng)促進血管內(nèi)皮細(xì)胞的生存,起到抗凋亡的作用,但是對于此通路Tie-2后途徑仍不清楚,據(jù)Kim[1]等研究推測,其抗凋亡的機理可能與PI3’-kinase/Akt調(diào)節(jié)的通路有關(guān)。我們應(yīng)用Western blotting方法檢測其對HCT-8細(xì)胞中的Tie-2、PI3K以及Akt三種蛋白的激活情況,并加入PI3’-kinase的抑制劑LY294002進一步檢測三種蛋白的表達,旨在發(fā)現(xiàn)Ang-1對HCT-8細(xì)胞的作用及其分子機制,為大腸癌的分子靶向治療提供一些參考。

1 材料和方法

1.1 主要材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-8(北京藥物研究所),DMEM培養(yǎng)基(Gibco),Ang-1(Pepretech),Western blotting檢測試劑盒、LY294002、GAPDH多克隆抗體(Santa Cruz),Tie-2多克隆抗體、PI3K多克隆抗體、Akt多克隆抗體(武漢博士德生物工程公司),即用型SP免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物工程公司),蛋白質(zhì)marker(Solarbio),其余均為國產(chǎn)或進口分析純試劑。

1.2 細(xì)胞分組

1.2.1正常對照組(C組)用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞凋亡組(0組)用無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2.3血管生成素-1組(Ang-1組):在0組培養(yǎng)液基礎(chǔ)上加入Ang-1(根據(jù)實驗結(jié)果選定后續(xù)實驗Ang-1的濃度為0.2 mg/L)。

1.2.4LY294002組(阻斷劑LY294002+Ang-1組):在Ang-1組培養(yǎng)液基礎(chǔ)上加入阻斷劑LY294002。

1.3 MTT法檢測條件培養(yǎng)基中細(xì)胞增殖情況

不同濃度的細(xì)胞消化后接種至6孔板。血清的培養(yǎng)基同步24 h后加入條件培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后,組織細(xì)胞裂解液反復(fù)吹打,裂解后,加凝膠上樣緩沖液,加熱、離心,稀釋后,于260 nm及 280 nm處測定吸光度值(A)。電泳,轉(zhuǎn)膜后封閉PVDF膜,分別加入一抗、二抗,觀察相應(yīng)蛋白條帶表達情況,用凝膠成像及分析系統(tǒng)分析蛋白顯色的密度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1MTT法檢測不同濃度的Ang-1蛋白對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8生長的影響蛋白在濃度為0.05 mg/L時對結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞株即有抗凋亡作用,且隨著濃度的增加抗凋亡作用平穩(wěn),根據(jù)實驗結(jié)果選定后續(xù)實驗Ang-1的濃度為0.2 mg/L(圖1)。

圖1 不同濃度的Ang-1對HCT-8細(xì)胞增殖的影響

2.2應(yīng)用Western blotting蛋白免疫印跡法檢測三種蛋白的表達見表1,圖2、3。

表1 Ang-1對HCT-8細(xì)胞的抗凋亡作用

圖2 HCT-8細(xì)胞中 Ang-1對 Tie-2、PI3K、Akt的激活及應(yīng)用LY294002抑制劑后三者的表達

圖3 a:0組與C組相比,P＜0.01;b:Ang-1組與0組相比,P＜0.01;c:Ang-1+阻斷劑(LY294002組)與Ang-1組相比,P＜0.01

3 討論

促血管生成素家族是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)皮細(xì)胞特異性的促血管生成因子(endothelium-specific proangiogenic factor)家族[2]。包括4種:Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4,它們均屬于酪氨酸激酶受體Tie-2的配基。Ang-1作為該家族中的重要一員,通過旁分泌的形式作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞[3],主要表達于血管周圍細(xì)胞和壁細(xì)胞,是Tie-2最主要的激動劑,在血管新生及維持血管完整和穩(wěn)定中起重要作用[4]。Stoeltzing等[5]應(yīng)用重組Ang-1轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29以評價Ang-1對腫瘤生長和血管形成的影響,結(jié)果提示,對于轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的病人,Ang-1可能起到抗腫瘤性藥物或抗血管滲透性藥物的作用。因此Ang-1作為抗腫瘤和抗血管通透性因子作用于轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌,有影響血管發(fā)生和血管通透性來阻止腫瘤轉(zhuǎn)移的潛能。然而Ang-1在不同腫瘤中其表達并不一致,如在膀胱癌的血清中Ang-1明顯高于非腫瘤組織和正常對照[6]。Tanaka等[7]研究發(fā)現(xiàn):Ang-1在肝癌和正常肝組織中的表達無顯著性差異。Alan[7]等研究發(fā)現(xiàn)Ang-1在胰腺腫瘤和正常胰腺組織中的表達無顯著性差異。Tait[9]分析了56個公開發(fā)表的關(guān)于腫瘤組織中Ang表達情況的研究資料并發(fā)現(xiàn),其中只有一半顯示腫瘤組織中Ang-1表達有所上調(diào)。本研究中,無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的HCT-8細(xì)胞中加入較少濃度(0.05 mg/L)即出現(xiàn)細(xì)胞增殖,結(jié)果提示,外源性Ang-1促進HCT-8細(xì)胞的增殖,即具有抗凋亡作用,同時應(yīng)用Western blotting蛋白免疫印跡法測定Tie-2抗體的表達降低,因此Ang-1對HCT-8細(xì)胞的抗凋亡作用可能是通過Ang-1/Tie-2途徑實現(xiàn)的。

國內(nèi)外文獻對Tie-2的受體后途徑還不清楚,Murakami T[10]等研究發(fā)現(xiàn)Ang-1通過P13K/AKT通路抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。Harfouche等研究發(fā)現(xiàn),Ang-1可以通過抑制3磷酸激酶活性,抑制線粒體酶釋放,上調(diào)生存蛋白等多個途徑抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡,而該作用也是通過Tie-2介導(dǎo)的[11]。Kim I等認(rèn)為,Ang-1是由血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍的支持細(xì)胞合成,通過旁分泌作用,與附近血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的Tie-2受體特異性結(jié)合并使其磷酸化,通過磷脂酰肌醇3激酶(P13K)、蛋白激酶B(Akt)、粘著斑激酶(FAE)等信號途徑[8,12,13],調(diào)節(jié)內(nèi)皮之間、內(nèi)皮-基質(zhì)之間相互作用,促進血管成熟、穩(wěn)定。本研究中,加入Ang-1蛋白,三種抗體Tie-2、PI3K、Akt的表達降低,結(jié)果提示,外源性Ang-1對HCT-8細(xì)胞的抗凋亡作用的實現(xiàn)可能是通過Tie-2/PI3K/Akt信號途徑。

LY294002是 PI3K特異性阻滯劑,它可抑制PI3K而阻滯Akt的活性,從而阻滯了PI3K/Akt通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),使P-gp不能磷酸化活化,不能發(fā)揮其藥物泵作用,從而提高腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性[14],逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥。本研究中應(yīng)用LY294002可以有效的降低Tie-2、PI3K和Akt的表達,更能進一步說明Ang-1對HCT-8的正調(diào)控效應(yīng),同時我們看到對Ang-1/Tie/Akt途徑的阻斷,可以有效地抑制HCT-8細(xì)胞的生長,達到治療腫瘤的作用,從而為大腸癌的靶向治療提供一些依據(jù)。當(dāng)然由于LY294002不溶于水,具有細(xì)胞毒性,現(xiàn)在僅限于體外研究,臨床應(yīng)用受限,因此,在以后的研究中,可采用該途徑的其他抑制劑如Akt抑制劑哌立福新(perifosine)等做進一步探討。

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