神經生長因子對哮喘小鼠TNF-α表達的影響

靳英麗,陳麗波,劉超英,魯繼榮

(吉林大學 1.白求恩醫學院 藥理教研室,吉林 長春130021;2.中日聯誼醫院;3.第一醫院)

支氣管哮喘是一種以氣道高反應性和慢性氣道炎癥為特征的變態反應性疾病,多種炎癥細胞及細胞因子介導了這一炎癥過程。與哮喘發病有關的細胞因子很多,其中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是哮喘發病過程中的重要因素。神經生長因子(NGF)是對神經元的生長、分化、存活期延長具有促進作用的一類神經營養因子。Bonini S等[1]在其研究中發現,哮喘患者血清NGF水平增高,且過敏性哮喘病人血清NGF水平比非過敏性哮喘病人高。對過敏性哮喘小鼠進行抗NGF處理,可明顯減輕哮喘引起的氣道高反應性。提示在哮喘發病的機制中,可能存在NGF與其它炎癥因子的協同作用,而此類協同的具體過程和發生機制,則有待進一步研究。

本研究應用抗NGF抗體對哮喘小鼠模型進行處理,研究NGF被動性降低對哮喘小鼠血清及肺組織TNF-α表達水平的影響,由此探討NGF參與哮喘發病的可能機制。

1 材料與方法

1.1材料動物:選取30只8-10周齡雌性BALB/c小鼠,體重20-24克,由吉林大學白求恩醫學院動物室提供。試劑:卵白蛋白(OVA,Sigma公司)、兔抗小鼠β-NGF多克隆抗體及小鼠TNF-αELISA檢測試劑盒(武漢博士德生物有限公司)、TaKaRa RNA LA PCR Kit(AMV)Ver.1.1及DNA Marker(大連寶生物公司)。設備:超聲霧化器(德國百瑞公司)、水平電泳儀和酶標儀(Bio-Rad公司)、PCR儀(AB-2700型)(基因公司)、凝膠圖像分析系統(UVI公司)。

1.2實驗動物分組及模型制備取30只8-10周齡雌性BALB/c小鼠,隨機分為3組:正常對照組、哮喘組、NGF阻斷組,每組 10只。(1)哮喘組:于實驗第1 d、第14 d致敏,即卵白蛋白 20 μ g由 1mg氫氧化鋁乳化,總體積200 μ l,腹腔注射。在第21～27 d,以超聲霧化器霧化3%OVA鹽水氣溶膠吸入激發,每天1次,每次30 min。(2)NGF阻斷組:哮喘模型建立同哮喘組,但于每次激發前3 h,先經鼻滴入抗小鼠β-NGF 抗體(稀釋度 1∶50)50 μ l。(3)正常對照組:在每次霧化及腹腔注射時均以等量生理鹽水應用對照。各組小鼠均于末次激發后24 h處死,取組織進行相關檢測。

1.3ELISA法測定血清TNF-α的含量末次霧化激發24 h后,麻醉小鼠,摘眼球取血約 500 μ l,2 000 rpm離心約2-3 min,取上清凍存于-70℃。收集齊后按照ELISA檢測試劑盒的說明書,測定TNF-α含量。

1.4RT-PCR法檢測肺組織中TNF-αmRNA的表達

1.4.1肺組織總RNA的提取:依據Trizol法總RNA提取試劑盒說明書操作。

1.4.2引物合成:TNF-α及內參照GAPDH引物均由上海生工生物工程公司合成。TNF-α上游引物:5′-ATGAGCACAGAAAGCATGATCC-3′,下游引物:5′-TCACAGAGCAATGACTCCAAAG-3′,擴 增 產 物 長 度 708 bp;GAPDH上游引物:5′-GGGTGATGCTGGTGCTGAGT ATGT-3′,下游引物:5′-AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGTC-3′,擴增產物長度616 bp。

1.4.3RT-PCR:用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄,反應體系為10 μ l。用PCR擴增系統擴增,反應體系為40 μ l,94℃預變性2 min,94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共30個循環,再72℃延伸7 min保護。PCR擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳,用凝膠成像系統測定各擴增條帶的吸光度(OD)值,將目的條帶與內參帶的比值作為其mRNA水平的指標。

1.5統計學處理所有數據均用均數±標準差(s)表示,應用SPSS11.5統計軟件處理,組間比較進行t檢驗,P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 ELISA法對血清TNF-α含量的測定

哮喘組、NGF阻斷組血清TNF-α的水平明顯高于正常對照組血清TNF-α的水平(P＜0.05),差異具有顯著性;NGF阻斷組血清TNF-α的水平低于哮喘組血清TNF-α的水平(P＜0.05),差異具有顯著性。結果見表1。

2.2 RT-PCR法檢測肺組織TNF-αmRNA的表達

TNF-α、GAPDH cDNA的擴增產物大小分別為708 bp、616 bp,與預計值相符(圖1)。電泳后,將凝膠在圖像處理系統上分析,得出二者的OD值。利用GAPDH cDNA的OD值作為參照,求出各組小鼠TNF-α mRNA表達的相對值,單位:%。哮喘組較正常對照組TNF-αmRNA表達明顯增強(P＜0.05),NGF阻斷組較哮喘組顯著減弱(P＜0.05)。結果見表1。

圖1 TNF-α的 RT-PCR檢測結果

表1 各組小鼠血清TNF-α含量和肺組織TNF-αmRNA的含量(s)

表1 各組小鼠血清TNF-α含量和肺組織TNF-αmRNA的含量(s)

注:*與正常對照組比較,P＜0.05;△與哮喘組比較,P＜0.05。

正常對照組 10 114.61±18.28 30.54±6.81哮喘組 10 196.83±46.05* 57.39±8.98*NGF阻斷組 10 136.27±24.68*△ 37.00±7.95*△

3 討論

早在三四十年代,人們就發現內毒素能引起小鼠移植腫瘤的出血壞死。1975年,Carswell等人發現卡介苗攻擊小鼠后再用內毒素處理,小鼠血清中出現一種能誘導腫瘤組織出血壞死的物質,故命名為腫瘤壞死因子(TNF)。根據來源和結構的不同,可將TNF分為TNF-α和TNF-β兩型。TNF-α的生物學活性占TNF總活性的70%～95%,TNF-α主要由單核-巨噬細胞分泌,其他類型的細胞,如成纖維細胞、淋巴細胞、平滑肌細胞等在一定條件下也具有產生和釋放TNF-α的能力。TNF-α是一種具有多種生物學效應的前炎癥細胞因子,與機體的炎癥、免疫反應有著十分密切的關系。適量的TNF-α對機體的保護反應是必需的,但過量的TNF-α則對機體產生損傷反應[2]。TNF-α參與哮喘氣道炎癥反應的作用機制主要為:(1)增加血栓素的血管收縮活性,使肺血管壓力升高,滲出增多,增高肺毛細血管通透性;(2)趨化活性巨噬細胞和中性粒細胞,激活過氧化物陰離子的產生,誘導氧化爆發、細胞脫顆粒等活性作用,導致氣道炎癥;(3)刺激多種細胞表達IL-8,使中性粒細胞大量進入呼吸道,產生高濃度細胞蛋白酶,使呼吸道腺體分泌增多致氣道阻塞;(4)誘導粘附分子、刺激多形核中性粒細胞粘附內皮,使嗜中性粒細胞游出血管壁增多,發揮致炎作用;(5)通過核轉移因子AP-1促進與炎癥有關的細胞因子受體的基因表達[3]。Silvestri M等[4]報道哮喘發作期患者TNF-α水平明顯高于緩解期及對照組,而且哮喘病情越嚴重,持續時間越長,其血清TNF-α濃度越高,反之病情越輕,持續時間越短濃度越低。在我們的實驗中,ELISA法測定了哮喘小鼠血清TNF-α水平,結果發現哮喘小鼠肺組織血清TNF-α水平均較正常對照組明顯增高,說明TNF-α參與了哮喘的發生。進一步應用RT-PCR法測定了肺組織TNF-αmRNA的表達,結果顯示,哮喘小鼠肺組織TNF-αmRNA的表達較正常對照組增高,說明哮喘小鼠血清TNF-α水平升高可能系由肺組織TNF-α mRNA表達增加,TNF-α生成增多,釋放入血所致。由此可知,TNF-α與哮喘有著密切的關系,參與哮喘的病理生理過程。

神經生長因子(nerve growth factor,NGF)是對神經元的生長、分化、存活期延長具有促進作用的一類神經營養因子,屬于神經營養因子家族成員之一。NGF是一種多功能的細胞生長和調節因子,除對神經系統的作用外,尚對免疫[5]、生殖[6]、細胞增殖[7]、造血[8]等具有廣泛的作用。NGF參與免疫炎癥調控以及復雜的神經-免疫相互作用機制,可認為是神經可塑性和免疫可塑性的雙重調控介質。支氣管哮喘是一種由多種炎癥細胞、細胞組分及神經遞質參與的氣道慢性非特異性炎癥。眾多實驗已證實,NGF在哮喘發病中具有重要的病理生理意義,包括可促成哮喘氣道炎癥、高反應性及氣道重塑[9]。

那么,NGF對TNF-α有何影響呢?有人[10]應用原位雜交方法結合顯微圖像分析,研究實驗性哮喘豚鼠下呼吸道和內臟感覺傳入部位TNF-αmRNA表達的變化以及NGF抗體對其的影響。結果發現哮喘豚鼠TNF-α mRNA的表達在氣道上皮、肺內炎性細胞、C7-T5段脊神經節及脊髓后角內均明顯上調;在哮喘+NGF抗體組,上述部位內TNF-αmRNA的表達明顯低于哮喘組。我們的實驗在測定哮喘小鼠肺組織TNF-αmRNA的表達及血清TNF-α水平的基礎上,觀察了拮抗NGF作用后哮喘小鼠TNF-α表達的變化。我們發現哮喘小鼠肺組織TNF-αmRNA的表達及血清TNF-α水平均較正常對照組增高,而應用了抗NGF抗體拮抗了NGF作用后TNF-α表達水平下降。由此,我們判斷NGF可能通過增進肺組織TNF-αmRNA的表達作為參與哮喘的發病機制之一。

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