重組腺病毒介導神經營養因子基因轉染對體外培養脊髓神經元存活和分化的影響

劉 然,王 蘋,范東艷,范洪學,郭 麗*

(1.吉林大學公共衛生學院衛生毒理學教研室,吉林長春130021;2.長春市中心血站;

3.吉林大學第一醫院;4.西藏大學醫學院)

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是一種發病率極高且較難治愈的疾病。因為SCI最終導致癱瘓,所以不僅給患者本人及家庭帶來嚴重的經濟負擔也帶來了巨大的社會問題[1,2]。如何在SCI后維持脊髓神經元存活和軸突的再生能力,延緩其變性壞死是目前神經科學和臨床科醫學迫切需要解決的難點和熱點問題。神經營養因子 (neurotrophic factors,NTFs)是一類調節神經系統發育、成熟、維持神經功能的天然蛋白質。神經營養因子是神經元存活和發揮功能的基礎,具有影響神經系統發育成熟,調節神經遞質的傳遞,影響神經損傷的病理反應,促進神經元修復和再生等功能,所以神經營養因子是保護神經元和促進其修復再生的必需因子。文獻報道,SCI后腦源性神經生長因子(BDNF)和NT3的表達上調可以促進脊髓神經元、軸突和髓鞘的再生修復[3,4]。本實驗通過觀察BDNF和NT3在體外脊髓神經元培養中的作用,比較它們對脊髓神經元生長發育作用的影響,為臨床上應用NTFs治療脊髓損傷提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物與器材動物:Wistar大鼠購自吉林大學醫學院動物中心。細胞培養試劑:DMEM/F12和胎牛血清購自Gibco公司。胰蛋白酶購自Gibco公司。兔抗鼠神經元特異性烯醇化酶 (neur onals pecific enolase,NSE)和Alexa Fluor 555標記的山羊抗小鼠IgG的二抗購于Molecular Probes公司,倒置相差顯微鏡Olympus公司。激光掃描共聚焦顯微鏡Olympus公司。Ad-BNNF和Ad-NT3為本實驗室采用pAdeasy系統構建的,BDNF或NT3基因插入pAd-ShuttleCMV,然后與缺乏E1和E3區序列的腺病毒大質粒pAdeasy-1,在E Coli BJ5183細胞中進行同源重組,293細胞內包裝病毒。重組腺病毒滴度為2×108VP/ml。

1.2脊髓背根神經節神經元分離參考文獻[5]的方法進行分離。取新生24 h Wistar大鼠,無菌條件下剝離背部皮膚及軟骨,暴露椎體外側隱窩中圓形脊神經節,逐個摘除,置于預冷PBS內,剝除神經節表面筋膜,置于另一個盛有預冷PBS的平皿中,眼科剪將神經節剪至0.5 mm3大小的碎塊,并用預冷PBS沖洗3遍,將組織塊移入盛有0.25%胰蛋白酶的離心管中,37℃培養箱中消化20 min,用含10%FBS的DMEM/F12培養基終止消化,吸管輕柔吹打數次,濾掉組織塊,離心(1 000 rpm/min 10 min),棄上清,以10%FBS的DMEM/F12培養基再次重懸,200目濾網過濾,計數細胞存活率為90%,調整細胞濃度為1×106/ml,接種于35 mm培養皿上。

1.3實驗分組細胞接種3 d后,分別加入重組腺病毒滴度為2×108VP/ml的Ad-BDNF和Ad-NT3,無血清轉染3 h,轉入正常培養基繼續培養15 d,以未加任何神經營養因子為對照。同時將BDNF和NT3聯合應用,并與單獨應用組進行比較。

1.4免疫熒光染色免疫熒光染色在誘導的不同時間收獲樣本。棄去培養基,用Hank’s溶液洗滌2次,加入4%的多聚甲醛溶液,固定30 min。用PBS洗滌3×5 min,加入0.1%Triton X-100處理15 min,5%山羊血清封閉1 h,加入一抗(NSE,1∶100),室溫孵育1 h,用PBS洗滌3×15min,加入Alexa Fluor 555標記的山羊抗小鼠IgG的二抗(1∶400),室溫避光放置1 h,PBS洗滌3×15 min,輕輕搖動。棄掉洗滌液,最后樣品均再用1 g/ml的Hoechest33342復染細胞核,室溫溫育5 min。甘油封片后,用Fluview 1000激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。陰性對照實驗中,用PBS代替第一抗體來排除非特異性的二抗結合。共聚焦顯微鏡觀察PMT(電壓值)為650,C.A(針孔值)為100,采用單通道掃描,檢測波長分別為405 nm和563 nm。陽性計數:×400熒光顯微鏡下,隨機選取6個區域用目鏡網格測同尺計算陽性細胞率(%),即陽性細胞數/網格范圍內的細胞總數,取平均值。

1.5統計學處理所有資料均采用SPSS13.0軟件包進行統計學處理。計量資料用(s)表示。

2 結果

2.1形態學觀察脊髓神經元細胞倒置顯微鏡下觀察培養24 h后,可見大部分細胞已貼壁且呈現均勻分布,胞體呈圓形或橢圓形,可見細胞突起。隨培養時間延長,神經元細胞突起增多形成網絡。培養的第9 d后鏡下可見,細胞數減少出現死亡細胞。神經元在普通培養基中可維持存活20 d左右。

2.2神經元細胞免疫熒光染色本實驗采用免疫熒光技術檢測原代培養的脊髓背根神經節神經元含量,結果顯示NSE陽性細胞,染色呈紅色熒光。正常培養6 d的脊髓神經元細胞中NSE陽性神經元占40%左右(見圖1)。

圖1 正常培養6 d的脊髓神經元細胞NSE免疫熒光染色(×400)

2.3神經營養因子對脊髓神經元存活的影響在BDNF和NT3轉染后,持續培養到第15 d,計數神經元的存活率。結果顯示,單純細胞培養組神經元僅有(25±2.18)%的存活;BDNF組神經元的存活率為(50±3.42)%;NT3組神經元的存活率為(42±3.12)%;BDNF+NT3組神經元存活率為(63±2.53)%。脊髓神經元存活率聯合應用與單獨應用相比有顯著性差異(P＜0.05)。

2.4NTFs轉染后不同時間脊髓神經元存活的變化在BDNF和NT3轉染后,持續培養的同時間點,觀察NSE陽性細胞數,結果發現在持續培養8 d時,NTs轉染組的NSE陽性細胞比6 d時間點略高。8 d后神經元死亡明顯減慢,而單純培養組的神經元存活呈線性下降(見圖2)。

3 討論

神經營養因子是維持神經元存活、分化和發揮功能的基礎。在體內脊髓神經元的存活不僅需要從血液中攝取營養物質,而且需要多種神經營養因子的支持,這些因子可來自神經細胞本身,也可來自外周細胞。當神經元受損處于凋亡前狀態,若給予積極的干預措施,有望逆轉或減緩神經元的變性壞死。文獻報道,BDNF能夠促進損傷后軸突的存活,還能促進神經元功能恢復[6,7]。Johnson等最近報道了NT3結合PDGF能夠促進神經前體細胞在脊髓損傷部位分化為神經元。Zhang等應用NT3修飾神經干細胞移植治療小鼠脊髓損傷模型,發現移植30天后,脊髓功能明顯改善,損傷部位轉染陽性細胞增加[8,9]。腺病毒載體作為一種高效的基因轉移載體被廣泛應用于外源基因轉導哺乳動物細胞。原因是腺病毒基因組結構穩定,可插入大片段的外源基因,不發生基因重排,對宿主細胞要求不嚴,可感染分裂期細胞,也可感染靜止期的細胞。另外腺病毒基因組不與宿主基因組發生整合,安全可靠,是基因治療的理想載體。本實驗采用重組腺病毒介導NT3和BDNF基因轉染體外培養的脊髓神經元,比較了神經營養因子對體外培養的脊髓神經元存活影響,發現BDNF和NT3均對脊髓神經元有一定的保護作用。并且兩種營養因子聯合轉染作用更強,表明兩種因子對脊髓神經元的存活有疊加效應,推測它們可能是通過不同的神經生長調節途徑發揮作用。觀察BDNF組、NT3組和BDNF+NT3組作用后不同時間點脊髓神經元的存活率,發現單純培養的脊髓神經元培養對照組隨培養時間延長細胞數目明顯減少。而添加NTFs組的脊髓神經元的存活率在8 d時略高于前一時間點。推測這可能是由于BDNF、NT3不僅對脊髓神經元具有營養、支持、保護的作用,而且還可能促進了神經前體細胞向神經元分化。實驗中分離提取的神經元取材于椎體外側隱窩中的脊神經節,這個區域除了含有大量的脊髓神經元外還有許多神經前體細胞,這些前體細胞具有分化潛能,在 BDNF和NT3的作用下,可能分化成脊髓神經元。Bonner等的實驗結果也證實了這個推測[10]。

圖2 NTFs轉染后不同時間脊髓神經元存活的變化

本實驗分離培養的脊髓神經元24 h后,可見大部分細胞貼壁呈現均勻分布,細胞突起明顯。隨培養時間延長,神經元細胞突起增多形成網絡。分別在培養的不同時間檢測NSE陽性細胞率,結果顯示,體外培養的脊髓神經元存活率隨培養時間延長下降,但NTFs作用的脊髓神經元存活率明顯高于對照組(P＜0.05),而且BDNF+NT3作用組的神經元存活率與各實驗組相比存活率最高。

脊髓損傷修復的機制雖然還不清楚,但目前的大量研究已經證實神經營養因子在脊髓損傷后的修復起到了關鍵性的作用。雖然各種因子由于其自身的特異性,使其發揮效應的途徑不盡相同,但總的來說神經營養因子在脊髓損傷后的修復是不可缺少的。隨著研究的不斷深入和對神經營養因子認識的不斷加深,脊髓損傷的治療將會取得更大的發展。

[1]Beattie MS,HermannGE,Rogers RC,et al.Cell death in models of spinal cord injury[J].Prog Brain Res,2002,137:37.

[2]Widenfalk J,Lundstr?mer K,Jubran M,et al.Neurotrophic factors and receptors in the immature and adult spinal cord after mechanical injury or kainic acid[J].J Neurosci,2001,21(10):3457.

[3]Gulino R,Lombardo SA,Casabona A,et al.Levels of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-4 in lumbar motoneurons after low-thoracic spinal cord hemisection[J].Brain Res,2004,1013(2):174.

[4]Bjartmar C,Wujek JR,Trapp BD.Axonal loss in the pathology of MS:consequences for understanding the progressive phase of the disease[J].J Neurol Sci,2003,206(2):165.

[5]禹曉東,羅卓荊,張 琳.嗅鞘細胞對培養脊髓神經元生長狀態的影響[J].中華神經外科疾病研究雜志,2006,5(1):40.

[6]Plunet W,Kwon BK,Tetzlaff W.Promoting axonal regeneration in the central nervous system by enhancing the cell body response to axotomy[J].J Neurosci Res,2002,68(1):1.

[7]Obata K,Noguchi K.BDNF in sensory neurons and chronic pain[J].Neurosci Res,2006,55(1):1.

[8]Johnson PJ,Tatara A,Shiu A,et al.Controlled release of neurotrophin-3 and platelet-derived growth factor from fibrin scaffolds containing neural progenitor cells enhances survival and differentiation into neurons in a subacute model of SCI[J].Cell Transplant,2010,19(1):89.

[9]Zhang L,Gu S,Zhao C,Wen T.Combined treatment of neurotrophin-3 gene and neural stem cells is propitious to functional recovery after spinal cord injury[J].Cell Transplant,2007,16(5):475.

[10]Bonner JF,Blesch A,Neuhuber B,et al.Promoting directional axon growth from neural progenitors grafted into the injured spinal cord[J].J Neurosci Res,2010,88(6):1182.