利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建IER5-SiRNA-Hela細(xì)胞系

李 莉,趙煥英,楊川杰,魯葦媛,郝 淳,喬 茶,周平坤,徐勤芝,丁庫(kù)克*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院,北京100069,2.首都醫(yī)科大學(xué),北京100069;3.河北醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院,河北 石家莊050000;4.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射毒理研究室,北京100850)

IER5(Immediate early response 5)基因位于人的1號(hào)染色體上1q25.3[1],屬于早期慢反應(yīng)基因家族中的一員。其對(duì)細(xì)胞有絲分裂-細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡可能發(fā)揮重要作用[2-4]。但至今對(duì)該基因輻射效應(yīng)的作用機(jī)理及其生物學(xué)功能尚不清楚[5,6]。因此,為了進(jìn)一步研究IER5基因的生物學(xué)功能與它在宮頸癌放療上的潛在應(yīng)用,我們利用RNA干擾技術(shù),構(gòu)建并篩選出IER5-siRNA質(zhì)粒,建立IER5基因表達(dá)抑制的細(xì)胞系,以利于開展今后有關(guān)的基因功能研究。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和質(zhì)粒

人宮頸癌細(xì)胞系(Hela)由本實(shí)驗(yàn)室保存,siRNA表達(dá)質(zhì)粒載體PsilencerTM 3.1-H1 hygro購(gòu)于Ambion公司。DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自博大泰克公司產(chǎn)品。

1.2 主要試劑

T4 DNA連接酶購(gòu)自Promega公司,質(zhì)粒提取試劑盒為vigrous公司產(chǎn)品,Hind III和BamH I為NEB公司產(chǎn)品,DMEM和Lipofectamine為GIBCO BRL公司產(chǎn)品,潮霉素(Hygromycin)B為Roche公司產(chǎn)品。Trizol試劑和反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品。IER5鼠抗人多克隆抗體購(gòu)自臺(tái)灣Abnova公司、Ecl顯色液購(gòu)自 Perkinelmer公司、Ecl Anti-Mouse IgG and Anti-Rabbit IgG(二抗)購(gòu)自Sigma公司等。

1.3 篩選編碼IER5基因的siRNA的DNA序列

通過檢索NCBI GeneBank得到IER5基因RNA全序列,選擇其編碼區(qū)(CDS)作為siRNA設(shè)計(jì)的靶序列。利用Ambion公司提供的在線設(shè)計(jì)工具,進(jìn)行初步設(shè)計(jì)與篩選,找出具有siRNA功能的可能靶序列及其對(duì)應(yīng)編碼siRNA的DNA序列。

1.4 構(gòu)建帶有編碼特異性沉默IER5基因的siRNA的DNA載體

將上述1.3中設(shè)計(jì)的編碼siRNA的DNA序列送到Invitrogen公司合成。將DH5α感受態(tài)與上述目的DNA混合,借助于具有抗生素的LB瓊脂培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng),通過挑菌、搖菌與提取質(zhì)粒DNA(按照試劑盒說明進(jìn)行操作),得到連接有 siRNA的 PsilencerTM 3.1-H1 hygro載體質(zhì)粒。

1.5 檢測(cè)所構(gòu)建的載體

將上述構(gòu)建的質(zhì)粒載體送到北京Invitrogen公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.6 將已構(gòu)建好的帶有編碼特異性沉默IER5基因的siRNA的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞

將測(cè)序正確的帶有編碼特異性沉默IER5基因的siRNA的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染人正常Hela細(xì)胞,建立單克隆細(xì)胞系。首先將4 μ g質(zhì)粒溶到 90 μ l Opti-MEM(無血清)培養(yǎng)基中,加入LipofectamineM2000試劑進(jìn)行培養(yǎng),利用含有潮霉素(將潮霉素配制成50 μ g/μ l,1 mlDMEM 培養(yǎng)基中加入10 μ l潮霉素)和血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行篩選,挑選出陽(yáng)性單克隆細(xì)胞系。通過兩個(gè)月的陽(yáng)性單克隆挑選和培養(yǎng),最終獲得轉(zhuǎn)染后的單克隆細(xì)胞。

1.7 應(yīng)用Real Time PCR方法檢測(cè)siRNA對(duì)Hela細(xì)胞中IER5基因的抑制效果

首先提取細(xì)胞系的總mRNA,再進(jìn)行總mRNA濃度分析與純度鑒定。在逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈的基礎(chǔ)上進(jìn)行Real Time PCR測(cè)試,檢測(cè)IER5的siRNA轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞的抑制效果。測(cè)試儀器為7300 Realtime PCR system,反應(yīng)循環(huán)40次,反應(yīng)體系為 20 μ l,反應(yīng)條件為 50.0℃/2 min、95.0℃/10 min、95.0℃/15 s、60.0℃/1 min。測(cè)試數(shù)據(jù)的處理為該儀器自帶的7300系統(tǒng)SDS軟件。測(cè)試引物序列如表1所示,以β-actin為內(nèi)參基因。

表1 Real-time PCR的引物序列

檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)以及陰性對(duì)照序列轉(zhuǎn)染的6號(hào)細(xì)胞mRNA水平,此外對(duì)照組的數(shù)據(jù)為該儀器測(cè)試β-actin的測(cè)量值。

1.8 應(yīng)用 Western blots方法檢測(cè) siRNA對(duì) Hela細(xì)胞中IER5基因的抑制效果

分別收集正常Hela細(xì)胞和特異性抑制IER5基因的siRNA轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞。用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(購(gòu)自Pierce公司)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后,每泳道上樣40 μ g總蛋白,使用 15%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)。電泳結(jié)束后,將蛋白轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜,并將膜放入5%牛奶TTBS溶液中,37℃孵育2小時(shí)。更換新鮮0.5%牛奶TTBS溶液,分別加入IER5鼠抗人多克隆抗體和β-actin單克隆抗體,4℃過夜孵育,洗膜,分別加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的 Anti-Mouse IgG和Anti-Rabbit IgG的二抗,室溫振蕩孵育2 h,洗膜,發(fā)光,洗片。

2 結(jié)果

2.1 編碼siRNA的DNA序列的設(shè)計(jì)結(jié)果

(1)編碼siRNA-12的DNA序列如下:

①正義鏈:5′-GATCCGCAGATGGAGTTCAAGCTG TTCAAGAGACAGCTTGAACTCCATCTGCTTTTTTGGAAA-3′(SEQ ID No.1)

②反義鏈:5′-AGCTTTTCCAAAAAAGCAGATGGA GTTCAAGCTGTCTCTTGAACAGCTTGAACTCCATCTGCG-3′(SEQ ID No.2)

其對(duì)應(yīng)的siRNA靶序列為:

5′-GCAGATGGAGTTCAAGCTGTT-3′3′-TT CGTCTACCTCAAGTTCGAC-5′

(2)編碼siRNA-16的DNA序列如下:

①正義鏈:5′-GATCCGCTGCATAAGAACCTCCTG TTCAAGAGACAGGAGGTTCTTATGCAGCTTTTTTGGAAA-3′(SEQ ID No.3);

②反義鏈:5′-AGCTTTTCCAAAAAAGCTGCATAA GAACCTCCTGTCTCTTGAACAGGAGGTTCTTATGCAGCG-3′(SEQ ID No.4)

其對(duì)應(yīng)的siRNA靶序列為:

5′-GCTGCATAAGAACCTCCTGTT-3′;

3′-TTCGACGTATTCTTGGAGGAC-5′。

(3)編碼siRNA-27的DNA序列如下:

①正義鏈:5′-GATCCGCCTCATCAGCATCTTCGGTTTCAAGAGAACCGAAGATGCTGATGAGGTTTTTTGGA AA-3′(SEQ ID No.5);

②反義鏈:5′-AGCTTTTCCAAAAAACCTCATCAG CATCTTCGGTTCTCTTGAAACCGAAGATGCTGATGAGG CG-3′(SEQ IDNo.6);

其對(duì)應(yīng)的siRNA靶序列為:

5′-GCCTCATCAGCATCTTCGGTT-3′;

3′-TTCGGAGTAGTCGTAGAAGCC-5′;

(4)陰性對(duì)照的DNA序列為:

①正義鏈:5′-GATCCCACTACCGTTGTTATAGGT GTTCAAGAGACACCTATAACAACGGTAGTTTTTTTGGA AA-3′;(SEQ ID No.7)

②反義鏈:3′-GGTGATGGCAACAATATCCACACG TTCTCTGTGGATATTGTTGCCATCAAAAAAACCTTTTCG A-5′。(SEQ ID No.8)

2.2 構(gòu)建帶有編碼特異性沉默IER5基因的siRNA的DNA載體

構(gòu)建3個(gè)帶有特異性沉默IER5基因的siRNA功能的載體——PsilencerTM 3.1-H1 hygro-siRNA,它們被分別編號(hào)為IER5-12-siRNA、IER5-16-siRNA、IER5-27-siRNA。

(1)下列為北京Invitrogen公司給予測(cè)試的質(zhì)粒載體結(jié)果:

①樣品編號(hào):16-2(16表示該質(zhì)粒來源于編碼IER5-16 siRNA的DNA序列,2表示由該序列構(gòu)建的第2號(hào)樣品)質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果見后面(2)中的①所示。

②樣品編號(hào):27-8(數(shù)字表示同上)質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果略。

③樣品編號(hào):27-12(數(shù)字表示同上)質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果略。

④樣品編號(hào):27-10(數(shù)字表示同上)質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果略。

測(cè)序結(jié)果表明:由IER5-12-siRNA構(gòu)建的載體,經(jīng)過測(cè)序得知未帶有編碼IER5-12 siRNA的DNA序列。而含有編碼IER5-27 siRNA的DNA序列與編碼IER5-16siRNA的DNA序列的PsilencerTM 3.1-H1hygro-siRNA表達(dá)載體測(cè)序結(jié)果正確,說明獲得了含有編碼IER5-27-siRNA和IER5-16-siRNA的DNA序列的PsilencerTM 3.1-H1 hygro-siRNA表達(dá)載體。

(2)測(cè)序結(jié)果顯示:IER5-16(IER5-27測(cè)序結(jié)果略)中正確插入了載體序列。

2.3 利用已經(jīng)構(gòu)建好的siRNA載體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞

轉(zhuǎn)染與潮霉素B篩選后,挑選單克隆細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),形成具有IER5基因沉默的新型細(xì)胞系,將它們編號(hào)為 1號(hào) 、2號(hào)、3號(hào)、4 號(hào)、5 號(hào)、6號(hào)細(xì)胞系 ,其中6號(hào)細(xì)胞系為陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)與5號(hào)細(xì)胞系來源于IER5-27-siRNA載體;4號(hào)細(xì)胞系來源于IER5-16-siRNA載體。

2.4 siRNA對(duì)Hela細(xì)胞中IER5基因抑制效果的檢測(cè)

(1)采用7300 real-time PCR system儀器檢測(cè)上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)以及用陰性對(duì)照序列轉(zhuǎn)染的6號(hào)細(xì)胞mRNA水平。該實(shí)驗(yàn)測(cè)試三批獨(dú)立樣品,其測(cè)試結(jié)果見表2。此外對(duì)照組的數(shù)據(jù)為該儀器測(cè)試β-actin的參考測(cè)量值。

將6號(hào)細(xì)胞的mRNA值定為1,按此進(jìn)行歸一化處理,則轉(zhuǎn)染細(xì)胞 1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)的mRNA 值分別為 2-10.824、2-15.246、2-14.392、2-9.708、2-9.115。從表3可以看出:在上述6種細(xì)胞中,IER5的mRNA水平表達(dá)最高的為對(duì)照組6號(hào),1-5號(hào)細(xì)胞中的IER5的mRNA表達(dá)水平顯著性的下降,其中,表達(dá)量最低的是2號(hào)細(xì)胞,其次是 3號(hào)、1號(hào)、4號(hào)、5號(hào)細(xì)胞。Control為整個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)的對(duì)照。

(2)將IER5-SiRNA-Hela細(xì)胞與正常Hela細(xì)胞進(jìn)行IER5蛋白測(cè)試,了解它們的IER5蛋白表達(dá)情況,同時(shí)驗(yàn)證在蛋白層面上IER5基因表達(dá)抑制的效果,具體結(jié)果見圖1。

表2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中IER5的表達(dá)結(jié)果

圖1 IER5-SiRNA-Hela細(xì)胞和正常Hela細(xì)胞的IER5蛋白表達(dá)情況

從圖1可看出,正常Hela細(xì)胞的IER5蛋白表達(dá)在接受2Gy和4Gy射線照射時(shí)最強(qiáng)、最明顯,而且2Gy對(duì)應(yīng)的蛋白條帶比4Gy對(duì)應(yīng)的蛋白條帶要深一些,說明不同輻射劑量引起IER5蛋白表達(dá)是有差異的,而IER5-SiRNA-Hela細(xì)胞的IER5蛋白在相同的照射劑量下表達(dá)不明顯,比對(duì)照組6細(xì)胞的IER5蛋白條帶還弱。正常Hela細(xì)胞的0Gy對(duì)應(yīng)的條帶比較淺,是因?yàn)樵摽椎鞍讟映霈F(xiàn)了漏膠所致。此結(jié)果表明我們成功地轉(zhuǎn)染并挑選、培養(yǎng)出IER5-SiRNAHela細(xì)胞系,在蛋白層面上其IER5基因表達(dá)也受到抑制。

2.5 轉(zhuǎn)染單克隆細(xì)胞系的細(xì)胞形態(tài)

2號(hào)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系為IER5基因表達(dá)抑制最好的細(xì)胞系,命名為IER5-siRNA-Hela。在普通顯微鏡放大倍數(shù)相同的情況下觀察到IER5-siRNA-Hela的細(xì)胞(圖2中左側(cè))比正常Hela細(xì)胞(圖2中右側(cè))稍大,如圖2所示。

圖2 IER5-siRNA-Hela細(xì)胞和Hela細(xì)胞的形狀與大小的對(duì)比

3 討論

IER5基因位于人的1號(hào)染色體1q25.3,cDNA全長(zhǎng)2 369 bp[1]。Williams等[2]證實(shí) IER5是一種富含脯氨酸且具有多個(gè)核酸位點(diǎn)的蛋白,與其它早期反應(yīng)基因pip92、IER2、ETR101一樣,具有同源氨基末端,其生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)與 pip92、IER2、ETR101相似,不同之處在于其轉(zhuǎn)錄激活不需要磷酸激酶C的活化。IER5啟動(dòng)子區(qū)域序列可由轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)決定并予以檢測(cè),包含多種AP-1位點(diǎn)及Ets-1位點(diǎn),但缺少CArG及類似CArG的序列。Cirelli等人研究在自然覺醒狀態(tài)與睡眠強(qiáng)制剝奪情況下一些早期反應(yīng)基因表達(dá)上調(diào),其中包括IER5。IER5基因的mRNA水平在睡眠剝奪8小時(shí)后表達(dá)上調(diào),屬于比c-fos稍慢一點(diǎn)的基因[7]。Zeng等人利用基因芯片對(duì)PSP引起骨髓白血病HL-60細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制進(jìn)行研究過程中發(fā)現(xiàn),IER5、AP-1、IER2、EGR1等早期轉(zhuǎn)錄因子通過上調(diào)表達(dá)調(diào)控PSP而引起細(xì)胞凋亡[8]。目前,對(duì)IER5基因的其它方面的研究不多,但總體來說,可能與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期有關(guān)。

siRNA技術(shù)通過引入雙鏈RNA引發(fā)轉(zhuǎn)錄后基因沉默,抑制細(xì)胞中某個(gè)基因的表達(dá),能比基因敲除技術(shù)更快捷的顯示基因的功能,是目前分子生物學(xué)領(lǐng)域中常用的技術(shù)[9-11]。

鑒于宮頸癌的發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì),嚴(yán)重危害婦女的健康,本研究選取宮頸癌的細(xì)胞系Hela細(xì)胞作為研究對(duì)象,試圖闡明放射治療情況下,Hela細(xì)胞中IER5的基因表達(dá)情況,因此,本研究首先構(gòu)建并篩選了特異性沉默IER5基因的Hela細(xì)胞系,以便深入研究。通過設(shè)計(jì)編碼特異性沉默IER5基因的siRNA的DNA序列,將編碼siRNA的DNA序列插入載體中形成發(fā)夾siRNA插入片段,然后與PsilencerTM3.1-H1 hygro載體連接,構(gòu)建得到PsilencerTM3.1-H1 hygro-siRNA表達(dá)載體,再通過轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞與潮霉素B篩選,經(jīng)過挑選單克隆細(xì)胞培養(yǎng)成細(xì)胞系(IER5-siRNA-Hela細(xì)胞系),經(jīng)mRNA水平及蛋白水平測(cè)試,說明IER5-siRNA-Hela細(xì)胞的IER5基因表達(dá)抑制效果明顯。從細(xì)胞形態(tài)上講,IER5-siRNA-Hela細(xì)胞與正常Hela細(xì)胞相比,IER5-siRNA-Hela細(xì)胞比Hela細(xì)胞體積稍大,說明本實(shí)驗(yàn)成功的獲得了特異性抑制IER5基因的IER5-siRNAHela細(xì)胞系,為研究IER5基因輻射誘導(dǎo)表達(dá)的機(jī)理研究及揭示IER5生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

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