高壓氧預處理對小鼠低氧耐受能力的影響

劉 潔 王 泳 武連華 高春錦*

(1.首都醫科大學附屬復興醫院高壓氧科，北京 100038;2.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院高壓氧科，北京 100020)

人們由低海拔地區進入高原地帶，由于環境氧分壓的變化造成組織器官缺氧，因為適應不全產生的不適和器質性病變統稱為急性高原病(acute mountain sickness，AMS)。由于急性高原病具有高發病率及高病死率的特點，預防高原病、提高高原低氧耐受能力已成為日益緊迫的問題。

本實驗旨在觀察在不同海拔高度缺氧腦損傷因子白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)及基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)活性的變化及高壓氧預處理對其影響，為高壓氧預治療提高機體低氧耐受能力預防高原病提供理論依據。本試驗得出的結果將在降低急性高原病發生率方面提供有益參考，其經濟效益和社會效益相當可觀。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組

40只3月齡Wistar小鼠，雌雄各半，體質量220～250g〔動物許可證號:SCXK(京)2002-0006〕，購自中國科學院遺傳發育研究所動物中心，于標準動物實驗室飼養，飼養條件為15℃，相對濕度10%，標準鼠飼料及純凈水喂養。

采用抽簽法將40只小鼠隨機分為3大組:空白對照組(control group)8只，不進行預處理及模擬高原病處理;3 000 m高原組16只、5 000 m高原組16只，分別分2組進行高壓氧(hyperbaric oxygen，HBO)及常壓常氧(normal pressure oxygen，NPO)預處理，24 h后進行模擬高原病處理。分組為3 000 m HBO組8只，3 000 m NPO組8只，5 000 m HBO組8只，5 000 m NPO組8只。

1.2 高壓氧預處理

使用動物用純氧艙，首先純氧洗艙10 min，使艙內氧濃度＞90%，放入動物10 min勻速升壓(氧流量約12 L/min)至2ATA，穩壓吸氧45 min(其間用純氧通風10 min，控制氧濃度大于95%)后，20 min勻速降壓(氧流量約7 L/min)至常壓。每日1次，連續處理3 d。

1.3 常壓常氧預處理

動物置于相同動物用純氧艙內，使用空氣通風但不加壓，時間為75 min，每日1次，連續處理3 d。

1.4 急性高原病模型建立

使用醫用低壓艙建立動物模型，高原組動物在進行預處理后24 h分別置于醫用低壓艙內模擬海拔3 000 m及5 000 m低壓缺氧環境(PB分別為81.2 kPa及67.8 kPa)，暴露24 h。為避免動物急性升壓和降壓反應，減壓速度控制于10 m/s，艙內壓力勻速減至相應壓力，艙內溫度控制在22℃ ～28℃，濕度控制在50% ～60%。

1.5 標本收集

高原組小鼠在低壓艙內暴露24 h后，由試驗操作者在相應低壓環境中迅速進行采血操作。使用0.3%異戊巴比妥溶液對小鼠進行腹腔麻醉(用量75 mg/kg)，暴露腹主動脈，使用醫用注射器抽取動脈血約5 mL。經遞物筒將血樣傳出艙外，2 500 r/min離心10 min，取上清置于一次性冷凍管中保存于-20℃冰箱中。對照組標本在常壓常氧條件下以相同方法進行采集，血清標本共計40份。

1.6 IL-6及MMP-9含量測定

IL-6(試劑盒由北京諾詩生物技術公司提供)及MMP-9(試劑盒由美國R﹠D system公司提供)的檢測使用酶聯免疫吸附法(ELISA法)，結果IL-6以pg/mL、MMP-9以ng/mL表示。

1.7 統計學方法

用SPSS 11.5軟件對實驗數據進行統計學處理，所得數據以均數±標準差(±s)表示，多組間參數比較使用析因方差分析。各組與對照組比較使用t檢驗進行分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組實驗動物血清中IL-6含量變化

3 000m及5 000 m HBO組及NPO組IL-6含量較空白對照組升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，3 000 m及5 000 m HBO組IL-6含量較同高度NPO組略有降低，但差異無統計學意義(P＞0.05)。5 000 m HBO組及NPO組IL-6含量較3 000 m組升高，差異有統計學意義(P＜0.05)。詳見表1。

表1 不同預處理條件下模擬高原病小鼠血IL-6含量比較Tab.1 Comparison of IL-6 contents in blood of AMS mice under different pretreatment conditions (pg/mL)

2.2 各組實驗動物血清中MMP-9檢測結果

3 000m及5 000 m HBO組及NPO組MMP-9含量較空白對照組升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，3 000 m及5 000 m HBO組 MMP-9含量較同高度NPO組略有降低，但差異無統計學意義。5 000 m HBO組及NPO組MMP-9含量較3 000 m組升高，差異有統計學意義(P＜0.05)。詳見表2。

表2 不同預處理條件下模擬高原病小鼠血基質金屬蛋白酶-9含量比較Tab.2 Comparison of MMP-9 contents in AMS mice’s blood under different pretreatment conditions (ng/mL)

3 討論

目前對于高原病的預防方法不多，其中載氧適應法由楊景義［1］在1983年首次應用于臨床，已取得一定效果。高壓氧治療理論上可以提高機體氧含量，改善微循環，抑制內皮損傷過程中某些物質的活性，延緩高原反應的發生。實踐中又有成功應用載氧適應預防高原反應的先例，如張西洲等［2］報道在海拔3 700 m處的受試者，進入富氧室12 h后其心肺功能得到明顯改善;彭兆云等［3］通過高壓氧暴露誘導小鼠低氧耐受發現高壓氧暴露能產生明顯的誘導動物耐受低氧環境的效應。這從側面證實了在進入高原前選擇合適的治療壓力及療程進行高壓氧治療預防急性高原病的可行性。

3.1 急性高原病動物模型的建立

急性高原病的發病需要特殊的高原低氧環境誘導，在平原地區建立動物模型存在一定困難。目前一般采用低壓艙減壓模擬低壓缺氧環境制作動物模型。陳有等［4］利用低壓氧艙減壓模擬高原環境，得出大鼠在復合缺氧寒冷運動時可以誘發高原肺水腫的結論。王昊等［5］研究發現利用低壓艙模擬5 000 m高度，低壓缺氧暴露5 h可成功制成血-腦脊液屏障通透性改變模型。楊曉文等［6］也通過低壓艙成功制成大鼠高原反應腦病理模型，并在暴露24 h后發現光鏡下硝酸鑭漏出血管腔等病理改變。本實驗選取24 h作為動物模型暴露時間符合高原腦水腫發生時間，實驗數據表明模型組血IL-6及MMP-9較對照組明顯升高，且隨著高度增加，IL-6及MMP-9的質量濃度增加，證明模型組動物出現明顯缺氧腦損傷，結合動物在低壓低氧暴露過程中精神萎靡、活動量短暫增加后明顯減少，可以初步證明模型組動物已出現急性高原病。

3.2 高壓氧治療對模型小鼠血中IL-6及MMP-9含量變化的影響

IL-6通過促進炎性反應而在多種中樞神經系統疾病的腦組織損傷中起重要作用。IL-6作為一種重要的炎性反應介質其機制可能是調節成熟中性粒細胞的功能，促進其浸潤及聚集，抑制其凋亡［7］。動物實驗［8］發現，大鼠大腦中動脈閉塞12 h后MMP-9活性顯著增高，在24 h達到高峰并持續5 d左右，給予抗MMP-9抗體可以有效縮小梗死灶體積。Asahi M等［9］發現，在大鼠腦缺血模型中，MMP-9在腦內轉錄及表達明顯增高，MMP-9基因敲除鼠的梗死灶體積較對照組明顯減小。MMP-9的過度表達通過破壞腦血管基底膜，從而在血-腦脊液屏障破壞、腦水腫形成及繼發性腦損傷及腦出血過程中發揮了關鍵作用［10］。綜上所述，IL-6參與低壓缺氧環境中組織炎性反應損傷，MMP-9參與毛細血管通透性改變，二者均在急性低壓缺氧損傷中起重要作用，故IL-6及MMP-9可以作為衡量缺氧腦損傷的指標。

高壓氧對血管內皮細胞有明顯的作用。Sheikh A Y等［11］研究發現高壓氧可明顯增加血管內皮細胞生長因子的濃度，影響內皮細胞的功能及內皮細胞纖維蛋白原的降解反應。高壓氧治療對血管內皮細胞的作用能減輕內皮損傷，減少白細胞黏附，從而中斷炎性反應的網絡級聯效應，減少IL-6等細胞因子的表達。唐杭軍等［12］對130例急性腦梗死患者分別進行常規治療與高壓氧及常規治療，結果2組治療后HBO組IL-6下降水平更低，這說明HBO治療在腦梗死急性期更能快速降低IL-6，快速減輕腦梗死后繼發的炎性反應。故高壓氧治療可降低體內IL-6含量，減少腦組織缺氧損傷，這與本實驗所得結果相符。

小膠質細胞在缺血早期參與缺血性神經元的損害過程，近年來人們發現活化的小膠質細胞可刺激MMP-9分泌。潘玨等［13］所做高壓氧對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷小膠質細胞的影響研究表明，高壓氧治療早期抑制小膠質細胞活化，缺血48 h后抑制MMP-9蛋白表達。故高壓氧治療可降低體內MMP-9含量，減少腦組織缺氧損傷，這與本實驗所得結果相符。

綜上所述，可以得出高壓氧治療可以使體內對于缺氧腦損傷敏感的IL-6及MMP-9 2因子含量降低，使腦組織缺氧損傷程度減輕。

3.3 高壓氧預處理對低氧耐受的影響

既往研究［14］證明高壓氧預處理可誘導沙土鼠海馬CA1區神經細胞對腦缺血產生耐受。由此可以佐證高壓氧預處理可通過增加氧儲備促使對低氧產生耐受，減輕細胞損傷和炎性細胞因子的釋放。李長春等［15］發現高壓氧預處理可抑制活化的小膠質細胞分泌細胞因子，從而改變了腦部的炎性反應進程。高壓氧預處理具有:① 增加氧儲備促使機體細胞對低氧產生耐受，減輕細胞損傷和炎性細胞因子的釋放;②對血管內皮細胞的作用能保護內皮，減少白細胞黏附，從而中斷炎性反應的網絡級聯效應;③ 抑制活化的小膠質細胞分泌細胞因子等重要作用。這些作用會使IL-6及MMP-9在缺氧損傷早期含量下降，減少炎性反應對組織的繼發性損害。這正與本實驗得出高壓氧預處理組較對照組IL-6及MMP-9含量降低的結果相符，說明高壓氧預處理對減少腦缺氧損傷有意義。但本試驗尚未得出在2ATA、治療時間升壓10 min-穩壓吸氧45 min-減壓20 min、療程1次×3 d的高壓氧預處理條件下IL-6及MMP-9兩因子的質量濃度在模擬不同海拔高度時顯著性降低，故此種高壓氧預處理方案可能對急性高原病無明確預防作用。這說明對于有效的預防急性高原病的高壓氧治療方案還需進一步摸索。

［1］楊景義.高海拔地區(＞4 800米)載氧適應對預防急性高原病意義的初步探討(附268例次載氧適應調查報告)［J］.青海醫藥雜志，1986(6):10.

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