葛根素對血管平滑肌細胞周期相關蛋白表達的影響*

沈曉君，魏 群，陳 芳，魏 晏

(1.河南中醫學院，河南 鄭州 450008;2.華中科技大學同濟醫學院，湖北 武漢;3.河南中醫學院第三附屬醫院，河南 鄭州450008)

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)增殖在動脈粥樣硬化(athemsclerosis，AS)、經皮冠狀動脈腔內球囊成型術后再狹窄和高血壓等多種心血管疾病的病理變化中起著重要作用[1]，因此促進過度增生的VSMC凋亡對防治AS有積極的意義。中藥黃酮類化合物葛根素(puerarin，C21H20O9)為豆科葛屬植物野葛干燥根中提取的異黃酮類主要有效成分之一，其化學名為4，7-二羥基-8-D-葡萄糖基異黃酮。研究表明，葛根素對冠心病、腦梗死等有很高的應用價值，是近年來研究證實對心血管疾病有明顯作用的中藥單體。本課題通過觀察葛根素對氧化低密度脂蛋白(oxLDL)誘導增殖的兔VSMC細胞周期變化及細胞周期調控相關蛋白E(cyclin E)和細胞周期素依賴性激酶抑制蛋白p27表達的影響，探討其可能存在的促進VSMC凋亡從而延緩或逆轉AS病變的作用，為葛根素抗AS藥理作用的研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株

兔主動脈平滑肌細胞由中國協和醫科大學基礎醫學院細胞培養中心提供。

1.2 藥品及試劑

葛根素標準品均購自中國藥品生物制品鑒定所，純度99%，20mg/瓶，批號200511;oxLDL由我室制備[2];胰蛋白酶、DMEM 為 Gibco BRL.USA 產品;胎牛血清購自杭州四季青公司;鼠抗人 p27單抗(1∶100)、兔抗人 cyclin E 單抗(1∶100)、羊抗鼠FITC-IgG(1∶400)、羊抗兔 FITC-IgG(1∶400)試劑均購自Santacruz.USA。

1.3 主要儀器

德國GMBH公司Hera C02細胞培養箱，蘇凈集團安泰公司209b型超凈工作臺，日本 Olympsu Optical公司 BH-NIC-B型倒置顯微鏡，BD.USA公司FACS Calibur流式細胞儀。

1.4 細胞培養與實驗分組

兔主動脈平滑肌細胞置于含有10%小牛血清的PRMI-1640培養基中，加入終濃度為 100mg·L－1的鏈霉素與青霉素，在37℃ 5%CO2條件下培養，用含0.01%EDTA的0.25%胰酶進行消化傳代，處于對數生長期的第3到第5代細胞用于實驗。細胞按1×108·L－1密度稀釋后接種于 96孔培養板培養24h，將細胞分為空白組、LDL模型組、葛根素藥物處理組，每組設6個復孔。除空白組外，各組均加入oxLDL，劑量為 50mg·L－1，培養 24h 后葛根素組分別加入終濃度 10－5mol·L－1、10－6mol·L－1，、10－7mol·L－1的葛根素，培養48h后分別收集細胞。

1.5 細胞周期分析

收集細胞 1000r·min－1離心 5min，棄去培養液;PBS洗滌2次;離心去PBS，加入冰預冷的70%的乙醇固定，4℃避光固定過夜。800r·min－1離心 10min去上清，PBS清洗 2次;重懸細胞于 500μl含100unit/ml RNaseA的 PBS緩沖液中，避光37℃孵育30min;加 2mg/ml PI至終濃度 50μg/ml，避光孵育30min，以PI熒光讀數為橫坐標，細胞數為縱坐標，在流式細胞儀上分析細胞周期。

1.6 細胞周期調控相關蛋白cyclin E和p27表達的檢測

取生長狀態良好的細胞胰酶消化后制備細胞懸液加入試管中，調整細胞濃度為1×106/mL個，加入鼠抗人p27、兔抗人 cyclin E單抗100μL，室溫孵育30 min，PBS 洗滌 1 次，300 ～500r·min－1離心5min去上清，加入羊抗鼠 FITC-IgG、羊抗兔 FITCIgG二抗 100μL，避光室溫孵育 30min，PBS洗滌 1次，300 ～500r·min－1離心 5min 棄上清，加入1mLPBS液，500目銅網過濾后上機檢測，每份標本測定5000個細胞，同時設PBS代替一抗和二抗、僅加一抗、僅加二抗的陰性對照。

1.7 數據統計與分析

2 結果

2.1 葛根素對VSMC增殖周期的影響

表1顯示，與 LDL組比較，葛根素組 G0/G1期細胞數增多，S期細胞數明顯減少 (P<0.01)，提示葛根素具有抑制VSMC增殖的作用。

表1 葛根素對VSMC增殖周期的影響(s)

表1 葛根素對VSMC增殖周期的影響(s)

注:與空白組比較:△P<0.01;與LDL組比較:*P<0.01

組 別 劑量 G0/G1 S G2/M空白組 —25.81±1.65 68.14±2.58 10.28±2.23 31.32±1.58模型組 50mg·L－1 39.92±3.09△ 26.83±1.89△ 37.13±2.01葛根素 10－7mol·L－1 57.47±2.62* 16.91±2.07* 19.56±2.76 10－6mol·L －1 57.39 ±2.51* 16.67 ±0.31* 22.32 ±2.14 10 －5mol·L －1 59.11 ±2.17* 14.04 ±1.89*

2.2 葛根素對VSMC cyclin E和p27蛋白表達的影響

表2顯示，流式細胞儀檢測結果顯示，葛根素處理組細胞cyclin E表達量隨淫羊藿苷與葛根素劑量增加而減少;p27蛋白表達量則明顯增加，與LDL組比較差異顯著(P<0.05、P<0.01)。

表2 葛根素對VSMC cyclin E和p27蛋白表達的影響(s，n=6)

表2 葛根素對VSMC cyclin E和p27蛋白表達的影響(s，n=6)

注:與 LDL 組比較:*P<0.05，**P<0.01

組 別 劑量cyclin E p27空白組 —9.85±1.17 19.63±1.25模型組 50mg·L－1 18.46±2.96 7.22±2.27葛根素 10 －7mol·L －1 14.13 ±1.66* 14.46 ±0.98**10 －6mol·L －1 13.57 ±1.71* 15.09 ±1.32**10 －5mol·L －1 11.27 ±1.09** 17.98 ±1.36**

3 討論

平滑肌細胞是血管壁中產生細胞外基質的主要細胞，在oxLDL等致AS刺激因子的作用下可分泌大量細胞外基質，遷移至內膜下增生并吞噬脂質，形成肌源性泡沫細胞。oxLDL不能被正常LDL受體識別，但可被巨噬細胞的清道夫受體識別并快速攝取，促進其形成巨噬細胞源性泡沫細胞。被激活的巨噬細胞還可釋放多種細胞因子，促進VSMC增生，形成AS病變。因此，血管壁內過多生成的活性氧使內皮下間隙的LDL氧化修飾生成oxLDL是AS病理過程中最重要的早期事件，在AS斑塊形成過程中具有重要的引發作用[3]。oxLDL不僅具有 VSMC的促增殖效應，而且對血管內皮細胞有損傷作用，兩者共同構成AS時血管損害的病理學基礎。

近年來的研究證實，葛根的異黃酮類成分有降血脂、降血壓、擴張冠狀動脈、降低心肌氧耗量、抗心律失常等作用，其對心腦血管疾病預防與治療的潛力逐步被發現并開發。我們前期的研究[4]證實，葛根素可抑制同型半胱氨酸誘導的VSMC過度增殖，促進其凋亡。本實驗中LDL模型組與空白組比較，G0/G1期細胞數減少，S期細胞數增多，進一步證實oxLDL具有VSMC的促增殖效應;葛根素組G0/G1期細胞數明顯增多，S期細胞數明顯減少，提示細胞周期阻滯是葛根素抑制VSMC過度增殖的機制之一。

細胞周期在細胞周期素(Cyclin)、細胞周期素依賴激酶(cyclin dependent kinase，CDK)、細胞周期素依賴激酶抑制因子(cyclin dependent kinase inhibitor，CDKI)組成的立體調控網絡精密控制下進行[5]。調節作用主要是通過 Cyclin隨細胞周期不同時相進行合成和降解，通過CDK有序的磷酸化和去磷酸化來實現[6]。G1/S是細胞周期啟動最重要的調控點，它是細胞惟一能從外界接受增殖信號或抑制信號的時期。G1/S調控點也是細胞周期重要的檢測點，此點決定細胞進入分裂程序、發生凋亡或進入靜止的 G0期。一旦細胞通過此限制點，就可以不依賴外源性的增殖、分裂信號刺激而自主地完成增殖周期。CyclinE作為調節亞基，與催化亞基CDK2形成活性復合物 CyclinE/CDK2，G1/S調控點是CyclinE/CDK2在細胞周期中的作用點，CyclinE/CDK2啟動DNA復制，驅動細胞由G1期前行至S期，決定了細胞的增殖趨勢。

P27蛋白是CDKI家族成員之一，具有參與細胞周期調控、誘導凋亡、促進細胞分化等多種生物學功能。P27為停止細胞分裂所必需，在休止細胞內高表達，而在增殖細胞內則呈低表達。P27蛋白通過抑制CDK或其復合物的活性來調控細胞周期進程，作為細胞周期負調控因子，P27與G1后期所形成的CyclinE/CDK2復合物結合，通過C-末端抑制CDK2磷酸化，滅活其激酶活性，阻止細胞由G1期進入S期，抑制細胞分裂、增殖，促進細胞凋亡。研究表明，抗有絲分裂原所誘導的細胞生長抑制均伴有P27蛋白水平升高[7、8]，上調 P27和下調 CyclinE 可發揮抑制 VSMC 增殖的作用[9、10]。本研究中，流式細胞儀檢測結果顯示，葛根素處理組細胞cyclin E表達量隨葛根素劑量增加而減少;p27蛋白表達量則明顯增加，提示葛根素使體外培養的兔VSMC細胞周期阻滯于G0/G1期的主要機制是負調控 G1→S期檢測點，使細胞不能由 G1期進入 S期，從而抑制VSMC細胞周期。本實驗結果表明，葛根素可通過細胞周期阻滯使VSMC增殖減弱，cyclin E和p27是其作用靶點之一。

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