檢測結(jié)核分支桿菌L型的兩種方法比較

李紅光 田艷生 王江勇 張衛(wèi)

結(jié)核病是由結(jié)核桿菌感染引起的慢性傳染病，研究表明，一些體內(nèi)有結(jié)核分枝支菌L型(MTB-L)存在的非活動性結(jié)核病患者的疾病具有潛在活動性，并有復(fù)發(fā)的可能［1］，且有可能將其DNA整合到體細胞染色體上，激活原癌基因、抑制抑癌基因或引起細胞遺傳特性的改變而致癌［2］。為此，我們以結(jié)核病和肺癌患者為研究對象，用MTB-L培養(yǎng)和TaqMan聚合酶鏈反應(yīng)(TaqMan-PCR)技術(shù)對其血液標本進行檢測，并對其臨床應(yīng)用進行評價。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2008年5月至2010年5月我院門診及住院患者222例，分為2組:(1)結(jié)核病組:112例，根據(jù)臨床表現(xiàn)、體征、胸部X線、CT、病理、實驗室檢查等確診。其中男73例，女39例;年齡13～64歲，平均年齡42歲。肺結(jié)核101例(據(jù)1998年中國結(jié)核病分類法，其中血行播散肺結(jié)核5例，繼發(fā)性肺結(jié)核68例，結(jié)核性胸膜炎28例)，淋巴結(jié)核6例，結(jié)核性腦膜炎3例，睪丸結(jié)核2例。(2)肺癌組:110例，經(jīng)胸部X線、CT、病理、實驗室檢查等確診。其中男77例，女33例;年齡43～78歲，平均年齡61.2歲。鱗癌36例，腺癌59例，肺泡細胞癌8例，低分化癌5例，支氣管黏液腺癌3例。2組一般資料具有均衡性。所有患者均采血2 ml×2(滅菌 EDTA-Na2抗凝管)。

1.2 方法 (1)溶血離心培養(yǎng)法［3］:取抗凝血 0.5～1.0 ml加入溶血管，溶血后3000 r/m水平離心30 min，取沉淀0.15 ml接種于92-3TBL液體培養(yǎng)基，混勻后置37℃培養(yǎng)1～3周，每周觀察1次，取沉淀物涂片進行IK抗酸染色鏡檢，陽性者移種至92-3TB液體培養(yǎng)基傳代(傳至第5代)返祖，并同時接種PNBMTB-L、TCH-MTB-L液體培養(yǎng)基鑒定分型。(2)TaqMan-PCR檢測:全血 DNA 提取(SDS 溶血法［4，5］):取全血 200 μl，加入 10%SDS 20 μl，混勻，室溫放置 10 min，加入雙蒸水 3 ml，混合，10000 r/m，離心10 min，沉淀部分用雙蒸水洗2次。去上清液后，沉淀中加入50 μl TB-DNA提取液，震蕩混勻后，100℃沸水浴10 min，15000 r/m，離心10 min，取沉淀部分備用。取沉淀7 μl加入反應(yīng)管(TB PCR 緩沖液 30 μl，MgCl 25 μl，熒光探針5 μl，Taq 酶3 μl)中，低速離心數(shù)秒，取出置全自動定量 PCR 儀上(PE5700擴增儀，美國 PE 公司)，50℃ 2 min，94℃ 5 min，93℃ 45 s，60℃ 129 s，循環(huán)40次。反應(yīng)結(jié)束后利用熒光定量PCR軟件分析:調(diào)節(jié)基線至適宜處，各擴增曲線與閾值線的交叉點對應(yīng)的橫坐標即為Ct值，根據(jù)標準曲線上濃度與Ct值的對應(yīng)關(guān)系，可求出各待測標本的初始濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法檢測結(jié)果比較 溶血離心培養(yǎng)法檢測結(jié)核病組、肺癌組的MTB-L陽性率分別為25%和40%，二者陽性率結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。TaqMan-PCR法檢測上述2組陽性率分別為77.7%和75.5%，二者陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)核病組、肺癌組的兩種檢測方法陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 兩種方法檢測血液中MTB-L結(jié)果 例

2.2 MTB-L鑒定分型 結(jié)核病組中培養(yǎng)出的28株MTB-L經(jīng)鑒定分型:人型結(jié)核分支桿菌23株，牛型結(jié)核分支桿菌5株，經(jīng)傳代返祖，恢復(fù)典型原菌者16株，污染4株。肺癌組中培養(yǎng)出的44株MTB-L經(jīng)鑒定:人型結(jié)核分支桿菌36株，牛型結(jié)核分支桿菌7株，恢復(fù)典型原菌者21株，污染3株。

3 討論

近年來，肺癌的發(fā)病率呈上升趨勢，居各種惡性腫瘤的首位。有的學(xué)者注意到:MTB可在抗生素、抗體、補體、溶菌酶等體內(nèi)外多種因素作用下導(dǎo)致細胞壁部分或完全缺陷形成MTBL，其小的原生質(zhì)體和濾過相與病毒的一些生物學(xué)特性相似，因此，MTB-L感染與肺癌的發(fā)生可能存在一定的關(guān)系。已從各種肺癌標本中分離培養(yǎng)、檢測出MTB-L，進一步證實MTB-L可進入肺癌腫瘤細胞特別是細胞核內(nèi)，引起細胞的惡變［1］。我們從肺癌患者的血液中獲得較高的MTB-L檢出率，應(yīng)進一步從分子生物學(xué)、遺傳學(xué)角度證實MTB-L與肺癌的關(guān)系，為肺癌的發(fā)病機制研究開辟一個新的領(lǐng)域。

我們采用的溶血離心培養(yǎng)法獲得較高的陽性檢出率(結(jié)核病組25.0%，肺癌組40.0%)，因紅細胞可黏附血液中大量的MTB-L，經(jīng)低滲裂解后，紅細胞表面及細胞內(nèi)的MTB-L釋放出來，經(jīng)離心濃縮，檢出率大為提高，方法簡便易行。但此法觀察結(jié)果較為困難:MTB-L缺壁程度不一，形態(tài)和染色多變，不易將其與一些具有抗酸性的細菌及多種非微生物結(jié)構(gòu)(如各種染料沉渣等)區(qū)別開來。肺癌組培養(yǎng)法陽性檢出率均明顯高于結(jié)核病組，考慮為肺結(jié)核組患者多處治療階段，MTB-L數(shù)量較少，且藥物等因素不利于培養(yǎng)檢出，而肺癌患者免疫力低下利于MTB-L生長、又無抗癆藥物的抑制，所以檢出率較高。

我們將血液標本溶血離心后接種92-3TBL液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，簡便易行，但取生長沉淀物IK抗酸染色觀察結(jié)果時發(fā)現(xiàn)，有些標本著色不佳，出現(xiàn)“鬼臉”現(xiàn)象，有的標本菌量較少，不易觀察，我們將液體培養(yǎng)物離心3000 r/m離心30 min后，IK抗酸染色延長至48～72 h，獲得滿意的結(jié)果。結(jié)核病組中28株MTB-L經(jīng)返祖，僅恢復(fù)典型原菌者16株，肺癌組中44株MTBL恢復(fù)典型原菌者21株，返祖成功率較低，是否有的MTB-L發(fā)生遺傳性改變或細胞壁缺陷較為嚴重，形成了穩(wěn)定型MTB-L，有待于進一步研究。

MTB-L可進入血流，并且在播散的過程中黏附于紅細胞表面，使其免疫黏附能力下降。所以從全血標本中進行MTBDNA檢測，較之血漿、血清、白細胞及單個核細胞標本，更能說明患者的感染狀況。MTB-L具有MTB的重復(fù)保守序列和一些特異性插入片段，常用于檢測 MTB的MPB64、MTP40、38-Kda等蛋白基因片段，IS986、IS6110等插入片段均可用于檢測MTB-L。朱明利報道，在肺結(jié)核患者外周血中MTB-L的檢出率為58.82%。我們用TaqMan-PCR技術(shù)定量檢測肺癌、肺結(jié)核患者全血標本中的MTB-L，更能為臨床提供可靠的依據(jù)。

1 Onwuamaegbu ME，Belcher RA，Soare C.Cell wall deficient bacteria as a cause of infections:a review of the clinical signficience.Int Med Res，2005，33:1-20.

2 田艷生，崔幸琨，郝彤，等.結(jié)核分枝桿菌L-型感染與肺癌發(fā)生的相關(guān)性研究.腫瘤，2009，29:1085-1089.

3 中華結(jié)核和呼吸雜志編輯委員會.結(jié)核分支桿菌L型的檢測方法(試行).中華結(jié)核和呼吸雜志，2003，2:67-69.

4 Rafi W，Venkataswamy MM，Ravi V，et al.Rapid diagnosis of tuberculous meningitis:a comparative evaluation of in-house PCR assays involving three mycobacterial DNA sequences，IS6110，MPB-64 and 65 kDa antigen.J Neurol Sci，2007，252:163-168.

5 Teruyuki T，Tomohiro NA.Novel technique of quantitative nested realtime PCR Assay for mycobacterium tuberculosis DNA.J Clin Microbiol，2006，44:1029-1039.