P-STAT3在子宮內膜異位癥中表達的初步研究

孟津 金海紅 姜麗 陳燕

子宮內膜異位癥(endometriosis，EMs)是育齡女性常見病之一。主要癥狀包括痛經、慢性盆腔痛和不孕等。近年來發病率日益上升，其高復發率始終困擾著婦產科醫生和廣大患者。Ems的發病機制尚不明確。STAT3是STAT家族的重要成員，STAT3的組成性激活普遍存在于人類腫瘤中，并廣泛參與腫瘤的侵襲轉移、血管發生、凋亡抵抗和免疫逃避等過程。而凋亡、血管發生、黏附侵襲和免疫正是當前Ems發病機制的研究熱點，被證實與子宮內膜異位癥的發生發展密切相關。Ems類似惡性腫瘤的生物學行為可能正是通過STAT3通路來實現的。本實驗采用免疫組織化學SP法檢測P-STAT3(STAT3的活化形式)在子宮內膜異位組織和正常子宮內膜中的表達，探討PSTAT3在子宮內膜異位癥發病中的作用，以期為子宮內膜異位癥的早期診斷和治療開拓新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 研究組:選取秦皇島市第一醫院婦科2008年1月至2011年1月經手術和病理證實的Ems患者40例的在位內膜和異位內膜組織標本(增殖期23例，分泌期17例)，患者年齡23～46歲，平均年齡(38±5)歲;平均體重指數(23.2±2.4)kg/m2。對照組:正常子宮內膜組織40例(增殖期25例，分泌期15例)，年齡27～49歲，平均年齡(38±5)歲;平均體重指數(22.9±2.5)kg/m2。2組間年齡和體重指數差異無統計學意義(P＞0.05)。2組患者月經規律，除外妊娠、哺乳期女性及其他婦科合并癥，無內外科合并癥及惡性腫瘤，術前6個月內未接受激素治療。

1.2 方法

1.2.1 試驗試劑:一抗為兔抗人P-STAT3多克隆抗體(美國CST公司)。即用型快速免疫組化MaxVisionTM檢測試劑盒和DAB顯色劑(福州邁新生物技術有限公司)。PBS緩沖液和橘櫞酸鹽緩沖液為自配。

1.2.2 檢測方法:所有標本經甲醛固定后常規石蠟包埋，制成4 μm厚連續切片。切片常規脫蠟、脫苯、封閉內源性過氧化物酶、抗原修復。依照SP試劑盒說明書操作。中性樹膠封片后顯微鏡下觀察，并用PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.2.3 結果判斷:以子宮內膜腺上皮細胞的細胞核著色為陽性細胞，參照Fromowitz等［1］的半定量積分法，以染色強度和染色范圍對實驗結果進行判定。染色強度分為:不染色計0分;弱染色(淡黃色)計1分;中等染色(黃色)計2分，強染色(棕黃色)計3分。染色范圍:隨機選取10個具有代表性的高倍鏡視野(×400)，每視野計數100個腺上皮細胞，按照陽性細胞百分率分為:陽性細胞0～5%計0分，陽性細胞6% ～25%計1分，陽性細胞26% ～50%計2分，陽性細胞51% ～75%計3分，陽性細胞＞75%計3分。每張切片的兩分數相加計算總分:0～2分為陰性(－)，3分為弱陽性(+)，4分為陽性(++)，5～7分為強陽性(+++)。

1.3 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，采用非參數Wilcoxon W檢驗、McNemar檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

P-STAT3在對照組子宮內膜組織與研究組在位和異位內膜組織中均主要表達在腺上皮細胞的細胞核，間質也有少量表達(圖1～3)。

2.1 P-STAT3在對照組子宮內膜的表達

2.1.1 表達強度:P-STAT3在對照組子宮內膜中呈弱表達，在25例增殖期中僅有1例陽性表達，在15例分泌期中有5例陽性表達，表達強度為(－)至(+)。

2.1.2 增殖期與分泌期的表達比較l:P-STAT3在對照組子宮內膜的表達強度分泌期高于增殖期，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表 1。

2.2 P-STAT3在研究組在位內膜中的表達

2.2.1 組間的表達比較 P-STAT3在研究組在位內膜中的表達強度高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

2.2.2 組間增殖期的表達比較:P-STAT3在研究組在位內膜中的表達強度高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

圖1 P-STAT3在對照組子宮內膜的陽性表達(SP×400)

圖2 P-STAT3在研究組在位內膜的陽性表達(SP×400)

圖3 P-STAT3在研究組異位內膜的陽性表達(SP×400)

2.2.3 組間分泌期的表達比較:P-STAT3在研究組在位內膜中的表達強度高于對照組，差異有統計學意義(P=0.05)。見表1。

2.2.4 增殖期與分泌期的表達比較:P-STAT3在研究組在位內膜中的表達強度增殖期與分泌期比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

2.3 P-STAT3在研究組異位內膜中的表達

2.3.1 增殖期與分泌期的表達比較:P-STAT3在研究組異位內膜組織中的表達強度增殖期與分泌期比較差異無統計學意義(P ＞0.05)。見表1。

2.3.2 組間的表達比較:P-STAT3在研究組異位內膜中的表達強度高于研究組在位內膜和對照組子宮內膜，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1、2。

2.3.3 組間增殖期的表達比較:P-STAT3在研究組異位內膜中的表達強度高于研究組在位內膜和對照組子宮內膜，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1、3。

2.3.4 組間分泌期的表達比較:P-STAT3在研究組異位內膜中的表達強度高于研究組在位內膜和對照組子宮內膜，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1、4。

表1 P-STAT3在不同子宮內膜中的表達 例

表2 P-STAT3在研究組異位內膜和在位內膜中的表達 n=40，例

表3 P-STAT3在增殖期病例組異位內膜與在位內膜中的表達 n=23，例

表4 P-STAT3在分泌期研究組異位內膜和在位內膜中的表達 n=17，例

3 討論

子宮內膜異位癥是指子宮內膜基質或上皮細胞在子宮體以外部位附著生長。近年來發病率逐步上升，國外在育齡婦女的婦科腹腔鏡術中研究發現，EMs病變已達45%［1］。EMs具有組織侵襲、局部播散、復發轉移等類似惡性腫瘤的生物學行為，臨床采用手術、藥物等多種治療方法，但效果并不滿意，復發率高。子宮內膜異位癥的病因及發病機制至今不明，主要有子宮內膜種植學說、誘導學說、體腔上皮化生學說等。但均未能對Ems的發病機制做出完滿解釋。

子宮內膜異位癥表現類似惡性腫瘤的生物學行為，及其與卵巢癌的關聯［2］，提示EMs與腫瘤間存在潛在聯系。STAT3廣泛存在人體多個組織，是JAK、EGFR、Src等多個致癌性酪氨酸激酶信號通路的匯集點，在多種類腫瘤細胞中存在STAT3過度激活，與腫瘤的異常增生、侵襲轉移、凋亡抵抗、血管發生和免疫抑制等密切相關。

STAT3通路是多種凋亡調節基因的上游基因，可能通過調節Ems的凋亡參與EMs的發病。對腫瘤的研究證實，伴隨STAT3的激活發生系列凋亡相關基因的改變及調亡的抑制［3］。而抗凋亡因子 Bcl-2、Survivin和促凋亡因子 Bax、Fas，C-myc、P53等通過改變Ems患者的異位內膜、腹腔環境等的凋亡而參與EMs的發生發展。EMs類似惡性腫瘤的凋亡抵抗、血管形成、侵襲種植等生物學行為及相對較高的惡變率可能都與凋亡異常有關。巨噬細胞誘導異位至腹腔的內膜細胞凋亡的能力下降和異位細胞抗凋亡能力上升是Ems的發病基礎［4］。本次研究提示EMs異位內膜組織中存在P-STAT3的高表達及周期性變化喪失，這與Harada等［5］的研究中發現異位內膜的調亡敏感性下降及失去周期性變化的結果相呼。

通過調節血管生成相關因子調控血管生成，可能是STAT3促進Ems發病的機制之一。子宮內膜異位病灶在腹腔種植后需要新生血管提供營養支持，所以血管生成對Ems的發生發展至關重要。Nap等［6］發現血管生成抑制劑能夠顯著減少裸鼠的微血管密度和異位病灶數量，證明抑制血管發生可妨礙子宮內膜異位病灶的維持和發展。STAT3作為重要的多功能誘導因子，于轉錄水平調節血管發生的各個方面。血管內皮生長因子(VEGF)是最重要的促血管生成因子。STAT3能夠直接誘導激活VEGF基因，還能夠誘導缺氧誘導性因子1α(HIF-1α)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)等促血管生成因子的表達。

調控基質金屬蛋白酶(MMPs)的活性而參與EMs的侵襲，是STAT3引發Ems的又一可能機制。MMPs是降解細胞外基質的重要酶類。Osteen等［7］提出，MMPs調節系統的改變促進Ems的子宮內膜脫落，對異位內膜細胞在腹腔的生長和侵襲發揮關鍵作用。Laudanski等［8］發現腹腔內環境中MMPs表達異常導致蛋白溶解能力紊亂，這也與Ems發病有關。而STAT3通路正是通過調控MMPs的活性促進細胞外基質的降解、調節腫瘤細胞黏附，參與腫瘤的侵襲轉移。

STAT3作為免疫逃避調節的關鍵點，可能促成內異癥的發生發展。內異癥與免疫因素的關系極為密切。正常情況下腹腔液中存在能夠維持腹腔內環境穩定的腹膜清除系統。而STAT3能夠抑制免疫刺激因子和刺激免疫抑制因子的表達，調節腫瘤的免疫逃避。異位內膜細胞中STAT3的高表達可能調節異位內膜細胞的免疫逃避，降低腹腔內環境對異位內膜細胞的清除能力，從而促進Ems的發生發展。

STAT3通過酪氨酸殘基或絲氨酸殘基的磷酸化而被激活。本次實驗采用免疫組化SP法檢驗激活狀態的STAT3(PSTAT3)在EMs患者的異位內膜組織中的表達。結果顯示，PSTAT3在Ems異位內膜組織中的表達強度顯著高于正常子宮內膜。而且，在月經周期的不同時相中，P-STAT3在Ems異位內膜組織中的表達強度均高于同期正常子宮內膜。Ems的異位內膜組織中存在P-STAT3的異常表達，這可能正是子宮內膜異位癥的發病原因。

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5 Harada T，Kaponis A，Iwabe T，et al.Apoptosis in human endometrium and endometriosis.Hum Reprod Update，2004，10:29-38.

6 Nap AW，Griffion AW，Dunselmang A，et al.Anti-angiogenesis therapy for endomet-riosis.J Clin Endocrinol Metab，2004，89:1089-1095.

7 Osteen KG，Bruner-Tran KL，Keller NR，et al.Progesterone-mediated endometrial maturation limits matrix metalloproteinase(MMP)expression in an inflammatory-like environment:a regulatory system altered in endometriosis.Ann N Y Acad Sci，2002，955:37-47.

8 Laudanski P，Szamatowicz J，Ramel P.Matrix metalloproteinase-13 and membrane type-1 matrix metalloproteinase in peritoneal fluid of women with endometriosis.Gynecol Endocrinol，2005，21:106-110.