mTOR信號通路對擴張性心肌病大鼠心肌纖維化進程調控作用的實驗研究

于溯洋 柳磊 李普

心肌纖維化重構主要指心肌細胞外間質內膠原含量或容積分數顯著增高，是擴張型心肌病的主要組織病理學改變［1，2］。心肌成纖維細胞是心臟的主要間質細胞，其分泌的Ⅰ型和Ⅲ型膠原構成心肌間質網絡的基本結構。心肌成纖維細胞的功能及結構改變在心肌纖維化發(fā)展過程中起十分重要的作用。哺乳類雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是細胞生長的中心調控因子，可以通過調控細胞外間質膠原蛋白的合成代謝影響器官纖維化進程。真核起始因子(eukaryotic initiation factor，eIF)是 mTOR的下游底物，當生長信號激活mTOR后，eIF-4E脫落，從而啟動蛋白質的翻譯［3］，eIF-4E通過調節(jié)mRNA的輸出速度而影響細胞生長和細胞周期進程，促進細胞生長、增殖。我們通過觀察擴張性心肌病大鼠心肌組織中mTOR和eIF-4E的mRNA表達變化及與心肌間質膠原容積分數相關性，探討mTOR信號通路在擴張性心肌病大鼠心肌纖維化過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 2周齡Wistar大鼠30只，雌雄各15只，體重(64±6)g，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。對所有大鼠進行編號，并隨機分為擴張性心肌病模型組(DCM組)和對照組，每組15只。

1.2 方法

1.2.1 模型制備:阿霉素是一種高效、廣譜抗腫瘤蒽醌類藥物，由于阿霉素與心肌組織的親和力明顯高于其他組織，因此有嚴重的心臟毒性，利用阿霉素制作擴張性心肌病的模型是已得到公認的廉價、簡單、實用的方法［4］。DCM組大鼠模型建立及標本制作:按體重2.5 mg/kg劑量尾靜脈注射阿霉素(浙江海正藥業(yè))，每周2次，連續(xù)6周，總劑量30 mg/kg。對照組注射相同體積的注射用水。喂養(yǎng)到第6周時以10%水合氯醛麻醉后，剪去胸毛，經超聲多譜勒儀取二尖瓣長軸切面行心動圖檢測各大鼠左心室結構和心功能參數:包括左心室舒張期末內徑(LVEDD)、左心室收縮期末內徑(LVESD)、射血分數(LVEF)、左心室內徑縮短率(FS)等。共取15個心動周期平均所得數作為測量值;然后處死大鼠，剪取左心室游離壁心肌組織0.9%氯化鈉溶液沖洗并除去脂肪后分為2塊，1塊液氮保存用于檢測mRNA，1塊10%甲醛溶液固定用于苦味酸-天狼星紅染色后行膠原容量分析。

1.2.2 病理學檢測:標本用中性10%甲醛溶液固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，行連續(xù)切片，切片厚度為4 μm，常規(guī)行天狼星紅染色:①經10%甲醛固定的組織取材大小1 cm×1 cm×0.2 cm;②病理常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋;③石蠟切片厚度4 μm;④二甲苯脫蠟至水洗;⑤置0.1%苦味酸天狼星紅染液中1 h;⑥自來水流水沖洗4 min;⑦染Harris’s蘇木素5 min;⑧各級濃度乙醇內脫水;⑨二甲苯透明、中性樹膠封片;⑩在偏振光顯微鏡下觀察。并用HPIAS-1000型高清晰度彩色病理圖文報告分析系統分析膠原容積積分(PCV)。

1.2.3 RT-PCR檢測:Trizol法提取細胞總RNA并進行反轉錄。分別抽提對照組和DCM組成纖維細胞的總RNA。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內參照，進行RT-PCR檢測。GAPDH:上 游 5 ＇-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ＇，下 游 5 ＇-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3＇，擴增產物長度452 bp。mTOR引物:上游 5＇AAGATGCTTGGGACAGGC3＇，下游 5＇GGTCCGAAGGTAGTTGG3＇，擴增產物長度 343 bp;p70S6K 引物:上游 5＇TTTTGGCTCGGAAGGTGG3＇，下游 5＇TGTCGGATTGGAAGTGGC3＇，擴增產物長度421 bp;電泳圖象以GelprO4版凝膠光密度分析軟件進行分析，其代表數值為平均光密度值，代表相應基因的表達量。并除以GAPDH的平均光密度值，所得數值作為各擴增產物的mRNA相對表達量。

1.3 統計學分析應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組選模資料 DCM組15只大鼠中，1只大鼠死亡，14只成模;成模大鼠出現擴張型心肌病病理改變。對照組15只大鼠無死亡。

2.2 2組大鼠超聲心動圖比較 與對照組比較，DCM組LVEDD、LVESD 明顯增加(P＜0.05)，LVEF、FS明顯降低(P＜0.05)。見表1。

表1 2組大鼠LVEDD、LVESD、LVEF、FS的比較

表1 2組大鼠LVEDD、LVESD、LVEF、FS的比較

組別 LVEDD(cm) LVESD(cm) FS(%) LVEF(%)0.53± 0.29 0.30±0.18 36.4± 2.6 71.5±1.2 DCM 組(n=14) 0.61±0.03 0.37±0.05 28.6±4.1 61.5±6.1 P值對照組(n=15)0.030 0.028 0.037 0.028

2.3 天狼星紅染色PCV檢測結果 天狼星紅染色及膠原容積積分結果:天狼星紅染色，正常小鼠心肌膠原纖維主要分布在血管周圍，心肌細胞間有少量的膠原纖維;DCM組除血管周圍有膠原纖維外。心肌細胞間有大量縱橫交錯的膠原纖維，排列紊亂，膠原纖維的量要明顯多于對照組(P＜0.05)。見表2、圖1。

表2 2組PCV比較

表2 2組PCV比較

組別 PCV(%)1.51±0.31 DCM 組(n=14) 3.36±0.75 P值對照組(n=15)0.015

圖1 心肌膠原形態(tài)特征及分布(偏振光顯微鏡×100)

2.4 左心室心肌組織mTOR、eIF-4EmRNA表達結果 RT-PCR擴增后，DCM組mTOR mRNA的表達量較對照組明顯增加，經光密度值分析，其相對表達量是對照組的(1.8±0.08)倍(P＜0.05);DCM組eIF-4EmRNA的表達量較對照組亦明顯增加。經光密度度值分析，其相對表達量是對照組的(1.97±0.06)倍(P＜0.05)。見表3。

表3 2組大鼠左心室心肌組織mTOR、eIF-4EmRNA表達比較

表3 2組大鼠左心室心肌組織mTOR、eIF-4EmRNA表達比較

組別0.0036 0.00510.38±0.03 0.73±0.07 DCM 組 0.68±0.03* 0.87±0.03*P值mTOR eIF-4E對照組

3 討論

擴張型心肌病的主要組織病理學改變?yōu)樾募〖毎蛲龊托募〖毎忾g質纖維化病變。目前所關注的各種致纖維化因子有血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、轉化生長因子β1(TGF-β1)、基質金屬蛋白酶及其組織抑制因子家族(MMPs/TIMPs)等，但心肌組織受到這些細胞因子作用后調控纖維化形成的具體信號傳導機制仍不完全清楚。本結果顯示擴張性心肌病大鼠模型其mTOR和eIF-4E的mRNA表達明顯增加，并且DCM組織膠原容積(CVF)同時明顯升高。結果提示mTOR/eIF-4E信號通路激活在擴張型心肌病心肌纖維化的進程中發(fā)揮一定作用。

mTOR整合來自于細胞內外的營養(yǎng)、生長因子、能量和環(huán)境壓力等信號，通過調控細胞外基質Ⅰ型膠原蛋白的合成代謝影響器官纖維化進程。在心、肝、肺、腎、皮膚等器官的纖維化疾病過程中均發(fā)現了mTOR信號傳導通路的激活，阻斷mTOR可以抑制細胞外基質的沉積，減輕甚至逆轉器官纖維化，因而抑制該信號通路已成為防治器官組織纖維化靶向治療的熱點［5－8］。Ikeda等［9］通過對心肌 LKB1 基因敲除激活 mTOR 信號通路的小鼠模型研究發(fā)現，mTOR及其下游調節(jié)蛋白表達增加，最終導致心肌間質膠原成分增多、纖維化，心房、心室直徑擴大心功能惡化。Gao等［10］在束扎大鼠大動脈建立的鼠心肌肥厚模型中發(fā)現阻斷mTOR信號通路可明顯改善模型動物的心肌肥厚和纖維化，并且顯著改善心肌肥厚纖維化所致的心功能惡化。以上研究成果證實了mTOR信號傳導通路與各種原因所致器官纖維化疾病之間的關聯。而本研究結果從實驗動物水平證實mTOR/eIF-4E信號通路激活在擴張型心肌病心肌纖維化的進程中通過調控心肌間質膠原水平對心肌纖維化進程發(fā)揮重要作用。

然而，雷帕霉素對擴張性心肌病的干預是否可以調控mTOR通路進而阻斷心肌纖維化的進程，從而為擴張性心肌病的有效治療提供新的思路和理論基礎，尚需我們進一步研究。

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