近紅外光譜技術(shù)預(yù)測玉米代謝能值定標模型的研究

婁瑞潁 劉國華 張玉萍 汝應(yīng)俊

飼料代謝能評定通常采用代謝試驗法。但其操作程序繁瑣，對試驗條件和操作人員要求高，耗時久、人力成本高，難以在飼料企業(yè)廣泛推廣應(yīng)用。目前，一般通過檢索飼料數(shù)據(jù)庫獲得飼料原料的代謝能值。已知飼料原料品種、產(chǎn)地、栽培措施、收獲期、儲存時間、加工方法、動物品種、年齡、生理狀況、飼養(yǎng)管理、飼料加工等因素均會導(dǎo)致飼料原料代謝能值的差異，因而飼料數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)不能準確反映特定原料的實際代謝能值。盲目地依據(jù)數(shù)據(jù)庫中的經(jīng)驗值制定配方，往往會導(dǎo)致營養(yǎng)過剩或缺乏，從而影響動物生產(chǎn)性能和企業(yè)經(jīng)濟效益。因此，亟待開發(fā)準確可靠的飼料代謝能快速評定方法。

近紅外光譜技術(shù)（Near Infrared Reflectance Spectro scopy，NIRS）是一種高效、快速的現(xiàn)代分析技術(shù)，一旦建立了相應(yīng)的定標方程，就能在一分鐘內(nèi)對未知樣品迅速作出定性或定量分析（劉建學(xué)，1998）[1]。目前已有大量關(guān)于NIRS應(yīng)用于配合飼料、同一類別飼料原料組合（能量飼料、蛋白飼料、粗飼料）的代謝能值預(yù)測的報道，但有關(guān)單一飼料原料代謝能值近紅外測定的報道較少。Edney等（1994）[2]和 Owens等（2009）[3]分別對大麥和小麥代謝能進行了NIRS定標。馮平等（1986）[4]和王文杰等（1992）[5]分別對小麥麩和次粉代謝能進行了NIRS定標。這些研究顯示，NIRS用于單一飼料原料的代謝能預(yù)測具有極大潛力。目前尚未有對玉米代謝能單獨進行NIRS定標的報道。

本試驗在生物學(xué)方法評定的55個玉米樣品代謝能值基礎(chǔ)上，建立玉米代謝能值的近紅外定標模型，為近紅外光譜技術(shù)用于單一原料代謝能值評定提供方法學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與制備

從我國河南、山東、遼寧、廣東、京津等地區(qū)采集有代表性的55個玉米樣品各100 kg，采集樣品無霉變、發(fā)酵、結(jié)塊和異味，符合飼料衛(wèi)生標準。多點取樣法采取約2 kg樣品，四分法取樣約500 g，粉碎后過0.45 mm孔篩，混合均勻，密封瓶分裝，置于2℃冰柜中保存，用于近紅外光譜數(shù)據(jù)采集。其余樣品用于代謝試驗。

1.2 玉米代謝能的測定

1.2.1 試驗動物與試驗日糧

采用單因子隨機區(qū)組設(shè)計，分3批進行，分別用于測定20個、20個和15個玉米樣品。采用AA肉雞為試驗動物，1～27日齡飼喂肉仔雞商品顆粒飼料。選用28日齡體重相近的健康A(chǔ)A肉仔雞，隨機分為1個基礎(chǔ)日糧組和不同來源玉米替代組，分別采食基礎(chǔ)日糧和玉米替代試驗日糧。每個處理設(shè)8個重復(fù)（公母各4個重復(fù)），每個重復(fù)8只雞。基礎(chǔ)日糧采用玉米－豆粕型日糧，其日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。玉米替代試驗日糧采用40%玉米+60%基礎(chǔ)日糧配制（聶大娃等，2008）[6]。所有日糧均按0.4%比例添加TiO2作為外源指示劑，充分混勻后冷軋制粒，粒徑4 mm，自然風干。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平（風干基礎(chǔ)）

1.2.2 飼養(yǎng)管理

1～27日齡按照品種推薦飼養(yǎng)密度標準采用網(wǎng)上平養(yǎng)，28～36日齡采用層疊式籠養(yǎng)，飼養(yǎng)密度為10只/m2。全期雞舍內(nèi)溫度控制按照《愛拔益加商品代肉雞飼養(yǎng)管理手冊》執(zhí)行，試雞自由采食、自由飲水，24 h光照。7日齡滴鼻接種新城疫和腎傳支二聯(lián)苗，14日齡飲水接種法氏囊疫苗，21日齡皮下注射接種禽流感疫苗。

1.2.3 樣品采集與制備

代謝試驗期7 d，28日齡開始，35日齡結(jié)束。28日齡開始飼喂試驗日糧，32～35日齡每天采用活動糞盤以重復(fù)為單位收集全部排泄物，揀掉散落的飼料，吹去皮屑和羽毛，充分混勻后采集部分樣品，均勻噴灑10%鹽酸溶液，－20℃保存。代謝試驗結(jié)束，以重復(fù)為單位將4 d排泄物混合均勻，置于烘箱中105℃15 min滅活酶和微生物，然后65℃烘72 h，回潮24 h。試驗期間每天按處理于飼喂時同步采集部分試驗日糧。將飼料樣、排泄物粉碎過0.45 mm分析篩，密封保存?zhèn)錅y化學(xué)指標。

1.2.4 測定指標及方法

測定風干飼料樣和排泄物中的水分、TiO2、總能、含氮量。水分含量采用GB5497—85測定，TiO2含量采用分光光度法測定（Short，1996），總能采用全自動氧彈測熱儀（IKA－C200）測定；含氮量采用全自動凱式定氮儀（KDY－9830）測定。

1.2.5 玉米代謝能值的計算公式

式中：RN——每攝入1 kg飼料沉積的氮量（g）；

34.39——每克尿氮的產(chǎn)熱量。

玉米代謝能值 =DB+（DT－DB）/0.4。

式中：DB——基礎(chǔ)日糧能值；

DT——試驗日糧能值；

0.4——玉米在試驗日糧中所占的比例。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件Descriptive Statistics模塊，對玉米AME和AMEn進行描述性統(tǒng)計。采用Unscramler 9.8定標軟件建立樣品組分濃度與光譜數(shù)據(jù)間的回歸模型，并計算校正決定系數(shù)（R2cal）、驗證決定系數(shù)（R2val）、校正均方根誤差（RMSEE）、驗證均方根誤差（RMSEP）以及平均偏差（Bias）。

1.3 玉米代謝能近紅外定標

1.3.1 儀器

DA7200型近紅外光譜儀（瑞典波通），光譜掃描范圍為950～1650 nm。隨機配備Simplicity XP和Unscramler 9.8軟件系統(tǒng)。

Simplicity XP用于采集及存儲樣品的原始光譜，樣品的組分濃度值與對應(yīng)光譜信息在此進行合并，導(dǎo)出到定標軟件。Unscramler 9.8定標軟件采用不同的光譜預(yù)處理方法和數(shù)學(xué)處理方法對光譜數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，運用不同的多元回歸方法建立樣品組分濃度與光譜數(shù)據(jù)間的回歸模型，并將校準模型導(dǎo)回Simplicity中，進行對未知濃度樣品的預(yù)測。

1.3.2 玉米樣品近紅外光譜采集

將玉米粉末樣品置于近紅外室內(nèi)放置24 h平衡溫度。開機預(yù)熱60 min后，上機采集樣品950～1650 nm區(qū)間的全光譜信息，每隔5 nm采集一個光譜數(shù)據(jù)，共采集141個光譜數(shù)據(jù)。每個樣品重復(fù)測量2次，重裝2次，以消除樣品顆粒度大小、取樣均勻性等因素對光譜的影響。掃描結(jié)束，將玉米代謝能實測值與光譜數(shù)據(jù)合并導(dǎo)出，為消除分次掃描的光譜誤差，每個樣品均導(dǎo)出其光譜平均值。

1.3.3 玉米代謝能近紅外定標模型建立

基于全光譜信息，采用不同的光譜預(yù)處理方法及方法間的組合對玉米原始光譜進行處理，然后采用軟件自帶的偏最小二乘回歸建立校正模型，同時運用交互留一驗證（指從校正樣品集中依次剔除一個樣品，以剩余的樣品建立數(shù)學(xué)模型，并用建立的模型預(yù)測被剔除的樣品的組分濃度，比較預(yù)測值與實測值間的符合程度）對模型的預(yù)測效果進行評定。所用光譜預(yù)處理方法包括多元散射校正（Multivariate Scattering Correction，MSC）、標準正態(tài)變量轉(zhuǎn)換（Transformation of Standard Normal Variable，SNV）、一階導(dǎo)數(shù)處理（First derivative，F(xiàn)D）和不采用任何處理（None）。

模型建立后，用校正決定系數(shù)（R2cal）、驗證決定系數(shù)（R2val）、校正均方根誤差（RMSEE）、驗證均方根誤差（RMSEP）以及驗證集的預(yù)測值與化學(xué)測定值間的平均偏差（Bias）對模型的優(yōu)劣進行綜合評定。各項決定系數(shù)（R2）越大，標準差及驗證集的預(yù)測值與化學(xué)測定值間的平均偏差（Bias）越小，模型的預(yù)測精度越高。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米代謝能值測定結(jié)果(見表2)

由表2可知，不同來源玉米代謝能值存在變異。AME平均值為 16.10 MJ/kg，極差為 3.92 MJ/kg，變異系數(shù)為5.97%；AMEn平均值為15.80 MJ/kg，極差為3.72 MJ/kg，變異系數(shù)為5.78%。

表2 玉米代謝能值測定結(jié)果

2.2 玉米樣品的近紅外光譜

掃描得到玉米樣品的近紅外原始光譜，見圖1。由圖1可見，在950～1650 nm全光譜范圍內(nèi)，供試玉米樣品表現(xiàn)出相同的光譜吸收趨勢，但在各個波長點有不同的吸收峰，表明玉米樣品的化學(xué)組成相同，但各組分的濃度有所差異。

圖1 55個玉米的近紅外原始光譜

2.3 玉米代謝能值的近紅外模型

不同光譜預(yù)處理方法玉米AME、AMEn校正及驗證結(jié)果見表3、表4。由表3和表4可知，玉米AME、AMEn獲得最優(yōu)校正模型的光譜預(yù)處理方法分別為MSC和 FD+SNV，R2cal均在 0.99以上，R2val均在0.81以上，RMSEE、RMSEP、驗證集的預(yù)測值與化學(xué)測定值間的平均偏差（Bias）均較小。

表3 不同光譜預(yù)處理方法玉米AME的校正及驗證結(jié)果

表4 不同光譜預(yù)處理方法玉米AMEn的校正及驗證結(jié)果

3 討論

Edney等（1994）[2]對大麥的真代謝能(TME)進行近紅外定標，近紅外預(yù)測值與實測值相關(guān)系數(shù)為0.95。馮平等（1986）[4]對小麥麩的AME定標，近紅外預(yù)測值與實測值相關(guān)系數(shù)為0.988，預(yù)測精度顯著優(yōu)于化學(xué)成分回歸法。王文杰等（1992）[5]對次粉的AME定標，近紅外預(yù)測值與生物學(xué)方法測定值相關(guān)系數(shù)為0.90。Losada等（2009）[7]對小麥、大麥、玉米、燕麥、豌豆等能量飼料組合進行定標，AMEn近紅外R2cal和R2val分別為0.863和0.823，預(yù)測效果優(yōu)于化學(xué)成分回歸法和體外酶解法。文中建立的玉米AME和AMEn的近紅外定標模型 R2cal和 R2val分別為 0.994和 0.810、0.998 和 0.813，定標預(yù)測效果與 Losada等（2009）[7]接近。

NIRS是一種間接分析技術(shù)，實際應(yīng)用中存在諸多影響其分析準確性的因素。史永剛等（2001）[8]指出，樣品代表性和實驗室化學(xué)分析誤差是影響近紅外分析準確性的主要因素，在建立定標時，應(yīng)嚴格按照標準方法的誤差要求對樣品的成分進行準確測定。本試驗玉米表觀代謝能值測定組內(nèi)變異小于5%，在定標過程中，對光譜異常樣品和濃度值異常樣品進行光譜重掃描和實驗室重分析，以保證基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的準確性。Williams等（1978）[9]指出，樣品粒度是影響近紅外預(yù)測準確性和精確性的重要因素，其原因是粒度不同影響樣品分布均勻性和光學(xué)表面性質(zhì)，使反射光分散，從而改變樣品的近紅外光譜。Williams等（1985）[10]指出，樣品中的待分析成分與水分子發(fā)生水合作用，對近紅外光譜會產(chǎn)生影響，此外，樣品含水量對粉碎后樣品顆粒度和分布均勻性也有顯著影響。本試驗的玉米樣品經(jīng)粉碎后全部通過0.45 mm分析篩，實驗室測定和近紅外掃描樣品粒徑統(tǒng)一，消除了樣品粒度對NIRS預(yù)測準確性的影響。為減少水分對近紅外模型預(yù)測的影響，參照Williams等（1984）[11]的報道，將玉米樣品保持在其穩(wěn)定的、自然狀態(tài)下的水分含量。同時為消除光譜采集誤差，掃描前，將樣品置于近紅外室內(nèi)放置24 h平衡溫度。將近紅外儀開機預(yù)熱1 h后方用于近紅外光譜采集。粉末樣品混勻后均用φ75 mm小樣品杯裝載，盡量壓實，用直尺將多余部分刮去，采用重復(fù)測量、重復(fù)裝樣，掃描結(jié)束取平均光譜，以消除樣品粒度大小、取樣均勻性等因素對光譜的影響。

樣品近紅外原始光譜中不可避免地含有來自儀器隨機噪音、基線漂移或偏移、樣品顆粒度大小和光散射等的噪音信息，這些噪音會嚴重干擾近紅外吸光值和樣品組分濃度間的線性關(guān)系，從而影響定標模型的精度和預(yù)測準確性。因此，在建模前常涉及到光譜預(yù)處理。常采用一階導(dǎo)數(shù)（FD）消除由于基線偏移引起的光譜差異，而采用多元散射校正（MSC）和標準正態(tài)變量轉(zhuǎn)換（SNV）消除樣品的粒徑差異或裝樣容器不一致等因素對光譜產(chǎn)生的散射影響（張銀等，2007）[12]。文中試驗發(fā)現(xiàn)，建立玉米AME最優(yōu)校正模型的光譜預(yù)處理方法為多元散射校正，而建立AMEn最優(yōu)校正模型的光譜預(yù)處理方法則為一階導(dǎo)數(shù)和標準正態(tài)變量轉(zhuǎn)換的組合。

4 結(jié)論

本文采用DA7200型近紅外光譜儀建立了玉米AME和AMEn的近紅外定標模型，R2cal均在0.99以上，R2val均在0.81以上，表明NIRS技術(shù)適用于玉米代謝能值的快速預(yù)測。

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