不同氧需求特性菌株在模擬腸道厭氧條件下的增殖

呼慧娟 范小燕 周 琳 楊彩梅

益生菌在飼料行業(yè)中的應(yīng)用，已經(jīng)有多年的歷史。許多試驗(yàn)證明，在合適的時候添加正確的菌株，對于改善動物腸道健康是有益的[1-2]。然而，不同的益生菌具有不同的生物學(xué)特性。從其對氧氣的需求特性來看，益生菌可分為好氧型、兼性厭氧型和嚴(yán)格厭氧型。在當(dāng)前應(yīng)用的益生菌中，芽孢桿菌的使用最為廣泛。其中，好氧的枯草芽孢桿菌、兼性厭氧的地衣芽孢桿菌和嚴(yán)格厭氧的丁酸梭菌最具代表性。

在畜禽飼料中添加益生菌的關(guān)鍵在于含有益生菌的飼料進(jìn)入動物消化道后益生菌的代謝能力。芽孢桿菌在體內(nèi)的作用過程是：芽孢活化為營養(yǎng)體，營養(yǎng)體大量增殖并代謝。無論芽孢是否活化為營養(yǎng)體，還是營養(yǎng)體是否會大量增殖，最關(guān)鍵的問題在于是否有良好的條件促使這個過程進(jìn)行。動物消化道中的條件是一定的，而問題在于外源益生菌能否適應(yīng)動物的消化道環(huán)境。動物的消化道中，從胃部到直腸，微生物呈幾何數(shù)量級增加，99.9%的腸道益生菌在回腸后段。也就是說，益生菌最主要的作用部位是在回腸后段至結(jié)腸段，而這些部位基本上是厭氧環(huán)境。所以，外源益生菌如果能夠起作用，就要適應(yīng)動物腸道的厭氧環(huán)境。從氧氣需求特性來看，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和丁酸梭菌顯然是不一樣的，其在腸道厭氧區(qū)的表現(xiàn)自然也會不同。這種不同，將會直接體現(xiàn)在益生菌的使用效果上。同時，其在動物腸道中的表現(xiàn)，也是確定其最適添加量的關(guān)鍵因素。

本試驗(yàn)根據(jù)當(dāng)前動物飼料中常見添加量來確定試驗(yàn)的初始菌株數(shù)量，通過腸道模擬來實(shí)現(xiàn)基本的厭氧環(huán)境，分別測定厭氧的丁酸梭菌、兼性厭氧的地衣芽孢桿菌和好氧的枯草芽孢桿菌3種典型的益生菌株的增殖情況，為益生菌在動物生理條件下的應(yīng)用提供科學(xué)的試驗(yàn)依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、丁酸梭菌3種菌株由浙江惠嘉生物科技有限公司菌種室提供，并經(jīng)16S rRNA測試鑒定。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 種子培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（枯草芽孢桿菌用）：蛋白胨 1 g、氯化鈉 0.5 g、牛肉膏 0.3 g、水 100 ml，pH 值7.0，121℃、20 min滅菌備用。

地衣芽孢桿菌種子培養(yǎng)基：0.5%氯化鈉、5%葡萄糖、1%蛋白胨、1%牛肉膏、水100 ml，pH值7.0，121℃、20 min滅菌備用。

RCM培養(yǎng)基（丁酸梭菌用）：胰蛋白胨1%、酵母粉0.3%、牛肉浸粉1%、葡萄糖0.5%、可溶性淀粉0.1%、氯化鈉0.5%、無水乙酸鈉0.3%、半胱氨酸鹽0.05%，pH值7.0、水 1000 ml，121 ℃、20 min滅菌備用。

1.2.2 生產(chǎn)培養(yǎng)基

枯草、地衣芽孢桿菌：葡萄糖1%，豆粕粉2.5%，硫酸錳、硫酸鎂等礦物元素約1.0%（部分配方略），初始pH值7.0。

丁酸梭菌：2%葡萄糖，豆粕4.5%，硫酸銨、碳酸氫鈉、硫酸錳礦物元素約0.3%（部分配方略），初始pH值7.0。

2 試驗(yàn)方法

2.1 不同菌株的菌種活化

枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌分別活化：將菌種凍干管分別轉(zhuǎn)接至對應(yīng)的種子培養(yǎng)基中（100 ml搖瓶），置37℃、180 r/min培養(yǎng)18 h后，按1%的接種量轉(zhuǎn)接至另一管種子培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)12 h。

丁酸梭菌活化：凍干管保藏菌株接種于裝有RCM培養(yǎng)基試管中，37℃靜止厭氧培養(yǎng)24 h，置80℃水浴10 min后，按1%的接種量轉(zhuǎn)接至另一管RCM培養(yǎng)基中，37℃厭氧靜止培養(yǎng)16 h。

2.2 不同菌株的厭氧培養(yǎng)

2.2.1 枯草、地衣芽孢桿菌厭氧培養(yǎng)

將活化的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌分別接種至裝有約18 ml液體生產(chǎn)培養(yǎng)基的試管中，每種菌做9～12個試管，接種至試管后保持初始菌數(shù)在106cfu/ml，維持pH值，置于厭氧培養(yǎng)箱中進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。

2.2.2 丁酸梭菌厭氧培養(yǎng)

將活化的丁酸梭菌接種至裝有約18 ml丁酸梭菌生產(chǎn)培養(yǎng)基的試管中，9～12個重復(fù)，保證接種后菌數(shù)為104cfu/ml，維持pH值，置于厭氧培養(yǎng)箱中進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。

2.3 培養(yǎng)條件

地衣、枯草、丁酸三株菌均在37℃、搖床上80 r/min條件下厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中，每隔特定時間，即在培養(yǎng)的第 0、4、8、12、16、20、28、34、48 h 取一個試管搖勻，測定一次菌落數(shù)，至菌數(shù)不再變化時停止檢測。

2.4 菌種活化結(jié)果預(yù)測

為保證接入?yún)捬跖囵B(yǎng)試管中的菌種數(shù)量符合要求，需在正試前預(yù)測菌種活化后的活菌數(shù)量，預(yù)測時菌種培養(yǎng)方法同菌種活化。

3 試驗(yàn)過程

3.1 菌種預(yù)測

根據(jù)菌種活化過程進(jìn)行檢測：枯草和地衣芽孢桿菌活化后菌數(shù)檢測結(jié)果為5億cfu/ml，丁酸梭菌活化后菌數(shù)檢測結(jié)果為5千萬cfu/ml。

3.2 厭氧培養(yǎng)測定

3.2.1 枯草和地衣芽孢桿菌培養(yǎng)(見表1)

表1 枯草、地衣芽孢桿菌接種量測算

將活化的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌（預(yù)測菌數(shù)為5×108cfu/ml）進(jìn)行10倍稀釋，取稀釋液0.4 ml接種至裝有18 ml液體生產(chǎn)培養(yǎng)基的試管中，每個菌做9根試管，置于厭氧培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。

3.2.2 丁酸梭菌培養(yǎng)(見表2)

表2 丁酸梭菌接種量測算

將活化的丁酸梭菌（預(yù)測菌數(shù)為5千萬cfu/ml）進(jìn)行100倍稀釋，取稀釋液0.4 ml，接種至裝有18 ml生產(chǎn)培養(yǎng)基的試管中，9個重復(fù)，置于厭氧培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。

4 結(jié)果與分析

4.1 3株菌株在模擬腸道厭氧條件下增殖計數(shù)結(jié)果(見表 3)

表3 3株菌株模擬腸道厭氧條件下增殖計數(shù)結(jié)果(cfu/ml）

4.2 菌株生長曲線

運(yùn)用EXCEL分析軟件，以時間為橫坐標(biāo)、菌數(shù)對數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制菌體生長曲線（見圖1）。

圖1 3株菌株在模擬腸道條件下增殖曲線

由表3和圖1可知：在模擬腸道厭氧條件下，枯草芽孢桿菌維持在106數(shù)量級，幾乎不能生長繁殖；地衣芽孢桿菌由106數(shù)量級增殖到108數(shù)量級，相比枯草芽孢桿菌有所提高，但在培養(yǎng)20 h時才接近增殖高峰，而且沒有明顯的快速增殖期；丁酸梭菌由104數(shù)量級增殖到108數(shù)量級，呈現(xiàn)出非常旺盛的繁殖速度，從開始培養(yǎng)就表現(xiàn)出快速增長的趨勢，第12 h就達(dá)到穩(wěn)定，接近增殖高峰。

5 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明：好氧的枯草芽孢桿菌在模擬腸道條件下生長微弱或者幾乎不生長。由于動物的后消化道環(huán)境更接近于無氧環(huán)境，所以好氧的枯草芽孢桿菌并不適合腸道環(huán)境，其在腸道環(huán)境中的增殖也非常有限。

兼性厭氧的地衣芽孢桿菌在模擬腸道條件下有一定生長，從106僅增殖到108數(shù)量級。相對來說，地衣芽孢桿菌比枯草芽孢桿菌更能適應(yīng)動物的腸道環(huán)境。地衣芽孢桿菌沒有明顯的快速增殖期，在培養(yǎng)20 h時才接近增殖高峰。

嚴(yán)格厭氧的丁酸梭菌呈現(xiàn)出非常旺盛的繁殖速度，由104數(shù)量級增殖到108數(shù)量級，從開始培養(yǎng)就表現(xiàn)出快速增長的趨勢，培養(yǎng)12 h就達(dá)到穩(wěn)定，接近增殖高峰。

從本試驗(yàn)我們可以發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌最適應(yīng)模擬腸道的無氧環(huán)境，可在腸道中迅速增殖。相對于枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，嚴(yán)格厭氧的丁酸梭菌在動物腸道環(huán)境中的應(yīng)用有著天然的優(yōu)勢。大量試驗(yàn)也證明了丁酸梭菌能有效調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，改善生長性能。劉來亭等[3]發(fā)現(xiàn)，在肉仔雞日糧中添加0.3%～0.9%的丁酸梭菌，能夠不同程度地提高肉雞平均日增重，降低發(fā)病率和死淘率，添加0.6%和0.9%丁酸梭菌顯著提高肉雞腸道絨毛長度（P＜0.05）。王保正等[4]試驗(yàn)結(jié)果表明，在哺乳仔豬教槽料中提前添加丁酸梭菌對豬的生長發(fā)育大有益處。丁酸梭菌在腸道內(nèi)增殖代謝產(chǎn)生大量生物丁酸，可以改善和治療腸道疾病。吳小平等[5]研究表明，丁酸梭菌可有效治療潰瘍性結(jié)腸炎。朱曉慧[6]、謝樹貴[7]等報道，丁酸梭菌對動物腸道有益菌有增殖作用和共生關(guān)系，對致病菌有拮抗作用，這主要是由于丁酸梭菌在動物腸道中大量增殖，產(chǎn)生了較多的有益代謝產(chǎn)物，而最主要的產(chǎn)物——生物丁酸，對于結(jié)腸炎的治療和結(jié)腸中的菌群平衡具有顯著作用。

許多報道認(rèn)為地衣芽孢桿菌對動物生產(chǎn)性能的改善有一定的效果[8－9]。地衣芽孢桿菌在腸道無氧條件下雖然沒有明顯的快速增殖期，而且達(dá)到增殖高峰的時間也較長，但有適度的增殖量，能夠適應(yīng)腸道厭氧環(huán)境，并產(chǎn)生有益的代謝產(chǎn)物，其通過產(chǎn)酶、奪氧等作用方式，可在一定程度上調(diào)整腸道菌群平衡，影響腸道的消化能力。

枯草芽孢桿菌在畜禽養(yǎng)殖上的應(yīng)用雖有一定的積極效果[10－11]，但由于其不適應(yīng)動物腸道的無氧環(huán)境，因此不能進(jìn)行有效的增殖代謝來調(diào)整腸道菌群平衡，也不會因腸道功能的改善而提高動物的生長性能。而枯草芽孢桿菌的一些積極作用，可能是源于其在固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。例如，由于它能分泌多種酶類和抗生素，對養(yǎng)殖水體的改善和病原菌的抑制起到一定作用[12－13]。所以，枯草芽孢桿菌的作用特點(diǎn)，與其說是益生菌本身的作用，不如說是其體外代謝產(chǎn)物的作用。另外，由于枯草芽孢桿菌的好氧特性，可消耗腸內(nèi)過量的氣體，造成厭氧環(huán)境，以利于厭氧菌繁殖。

6 小結(jié)

①在厭氧條件下，丁酸梭菌菌數(shù)從接種時的104cfu/ml短時間內(nèi)即可增殖到108數(shù)量級，可見丁酸梭菌能充分適應(yīng)腸道的厭氧環(huán)境；

②地衣芽孢桿菌增殖到108cfu/ml，但由于其初始接種數(shù)量為106cfu/ml，與丁酸梭菌相比，其在厭氧條件下增殖速度不如丁酸梭菌；

③枯草芽孢桿菌在厭氧條件下，僅維持到106cfu/ml，有研究表明，當(dāng)一種菌在腸道內(nèi)的增殖僅在107數(shù)量級及以下時，其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物不足于對腸道健康產(chǎn)生影響。可見，由于其好氧特性，枯草芽孢桿菌在腸道的適應(yīng)性方面存在先天不足。

[1]荊忠良,張海峰,王振平,等.微生態(tài)制劑的研究進(jìn)展及其在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].山東畜牧獸醫(yī)，2007,30(3)：50－51.

[2]潘康成，馮軾.微生態(tài)制劑在綠色養(yǎng)殖中的作用[J].中國家禽，2008，30(14)：39－41.

[3]劉來亭，田鵬飛，杜靈廣，等.酪酸菌對肉雞生產(chǎn)性能和死淘率及小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(7)：130－134.

[4]王保正，楊清付，董曉東,等.酪酸菌對豬生長特性的影響[J].飼料工業(yè)，2007，28(16)：39－40.

[5]吳小平，劉德良，凌奇荷.酪酸菌對大鼠右旋葡聚糖硫酸鈉結(jié)腸炎的治療作用[J].中華消化雜志，2003，23(5)：305.

[6]朱曉慧，唐寶英，劉佳.酪酸菌對腸道有益菌的增殖作用和共生關(guān)系研究[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2004，16(4)：193－196.

[7]謝樹貴，戴青，趙述淼,等.丁酸梭菌對動物致病菌的拮抗作用研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2007，46(3)：424－426.

[8]郝生宏，佟建明.地衣芽孢桿菌對0～3周齡肉仔雞的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報，2008，36(8)：20－24.

[9]肖定福，胡雄貴，羅彬，等.地衣芽孢桿菌對仔豬生產(chǎn)性能和豬舍氨濃度的影響[J].家畜生態(tài)學(xué)報，2008，29(5)：74－77.

[10]朱五文，施偉領(lǐng)，陳曉峰.不同劑量枯草芽孢桿菌制劑對斷奶仔豬飼養(yǎng)效果試驗(yàn)[J].畜牧與獸醫(yī)，2007，39(8)：32－33.

[11]余東游，毛翔飛，秦艷，等.枯草芽孢桿菌對肉雞生長性能及其抗氧化和免疫功能的影響[J].中國畜牧雜志，2010，46(3)：22－25.

[12]李鳳剛，鄔立剛，岳增華.產(chǎn)酶益生素對肉雞增重及雞舍環(huán)境的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2006(8)：43－44.

[13]劉慧玲，黃翔鵠，李長玲,等.不同濃度的枯草芽孢桿菌對羅非魚魚苗的養(yǎng)殖水體水質(zhì)及其抗病力的影響[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖,2009,30(10)：5－9.