木瓜蛋白酶的酶學特性及其在飼料工業中的應用

馮定遠 陳芳艷

木瓜蛋白酶類主要存在于番木瓜的根、莖、葉和果實中，以未成熟的果實乳汁中含量最高（葉啟騰等，1999；趙元藩等，1999；乙引等，2000）。由于木瓜蛋白酶具有很強的分解蛋白質能力，并且有水解酰胺鍵和酯鍵的特性，因而廣泛應用于醫藥、食品、紡織、制革、飼料及染料等工業（吳顯榮等，1988）。

1 木瓜蛋白酶的概況

由木瓜乳汁加工而成的木瓜蛋白酶不是純酶。這些粗酶中除含有木瓜蛋白酶外，還含有溶菌酶、半胱氨酸蛋白酶、纖維素酶、葡聚糖酶、谷氨酰胺以及低分子量的巰基化合物。據等電點的不同，木瓜乳汁中所含的半胱氨酸巰基酶可分為三大類：木瓜蛋白酶（papain）、成分復雜的木瓜凝乳蛋白酶（Chymopapain）、溶菌酶（Lysozyme）。木瓜蛋白酶的pI為9.55，木瓜凝乳蛋白酶pI為10.10，木瓜肽酶pI>11.0，在近中性的條件下進行陽離子交換柱層析，可以很容易地將這三大類酶分開。在木瓜乳汁中木瓜蛋白酶占可溶性蛋白的10%左右，木瓜凝乳蛋白酶占45%，木瓜溶菌酶（Lysozyme）占 20%（凌興漢等，1998）。

2 木瓜蛋白酶的結構

2.1 木瓜蛋白酶

木瓜蛋白酶是最早被發現、研究和得以廣泛應用的酶，1937年Balls和Lineweaver用分級鹽析法從新鮮木瓜汁中提取了結晶木瓜蛋白酶，1970年完成了木瓜蛋白酶的序列測定，1971年通過X晶體衍射法測定了其三級結構。

木瓜蛋白酶的相對分子質量為21000，為單一肽鏈，由212個氨基酸殘基組成，1969年Husain和Towe報告了該酶的氨基酸排列順序（見圖1）。

木瓜蛋白酶共有七個半胱氨酸殘基，其中六個形成三個鏈內的二硫鍵，另外一個游離的半胱氨酸殘基為活性中心的必需氨基酸殘基之一。Drenth等測出了木瓜蛋白酶分子的三級結構，呈橢圓狀，由兩個結構域組成，交界處為一狹溝，酶的活性中心位于此狹溝中（陳自珍，1978）。

圖1 木瓜蛋白酶氨基酸排列順序

2.2 木瓜凝乳蛋白酶

木瓜凝乳蛋白酶由Jansen和Balls在1941年首次發現、提取并命名（Jansen等，1941）。木瓜凝乳蛋白酶的成分比較復雜，1967年，Kunimitsu等用離子交換柱分離木瓜凝乳蛋白酶，根據洗脫的先后順序將它分為兩類：木瓜凝乳蛋白酶A和B；1982年，Brocklehurst等報道了木瓜凝乳蛋白酶存在4個組分，1985年他們用極緩的NaCl梯度洗脫出5個活性峰（Kunimitsu 等，1985；Brocklehurst等，1987）；Silvia 等(1989)對木瓜凝乳蛋白酶的4種亞型進行了圓二色譜分析。目前已發現木瓜凝乳蛋白酶存在著不同亞型，它們之間僅有一或兩個氨基酸的不同（Buttle等，1984）。據EMBL/GenBank/DDJB等數據庫提供的數據可知，目前至少有9種亞型，它們分別由不同的基因編碼組成，其中6種亞型的多肽鏈由218個氨基酸組成，2種由227個氨基酸組成，1種由226個氨基酸組成。9種亞型的氨基酸序列見圖2。比較結果顯示，在這9種亞型中，只有亞型Ⅱ、亞型Ⅲ和亞型Ⅴ中個別位點的氨基酸與其他亞型的不同。

Maes等(1996)和Azarkan等(1996)測定了木瓜凝乳蛋白酶的立體結構（見圖3），從圖3可見，木瓜凝乳蛋白酶的多肽折疊形成兩個大小相同而形狀不同的結構域——L域和R域。L域主要是α-螺旋結構，R域主要是反向平行的β-折疊結構。活性中心位于這兩個域的交界面上。木瓜蛋白酶屬于α+β類，其中木瓜蛋白酶C端結構域為全α螺旋結構，N端結構域為全β-折疊結構（Schulz等，1979）；而木瓜凝乳蛋白酶屬于α/β類，二級結構中含有更多的α-螺旋和β-折疊，并且二級結構的折疊方式也是不同的（Ssolis-Mendiola等，1992）。

圖3 木瓜凝乳蛋白酶的立體結構

木瓜凝乳蛋白酶共有8個半胱氨酸殘基，其中6個形成了鏈內的二硫鍵，還有另外兩個活性自由巰基，處于第25和第117的半胱氨酸殘基，由于相距較遠，處于不同的區域，因此不能形成分子內二硫鍵。兩個殘基的活性相似，從木瓜凝乳蛋白酶的三維模型看，Cys117處于分子表面，易于與衍生試劑結合，而且易于被完全而不可逆地氧化。具有催化功能的Cys25和保守的Cys22和Cys56組成S1微場所。由于S1微場所的“口袋”比較大，對酶的底物特異性幾乎沒有影響。而由 67、68、69、133、157 和 207 位點的殘基構成的S2微場所影響著酶的底物特異性（Maes等，1996）。

2.3 木瓜溶菌酶

1955年，史密斯等從木瓜乳液中分離出了木瓜溶菌酶的純品結晶。后來Haward和Glazer查明了該酶的結構和性質。木瓜溶菌酶分子量為24000，與動物溶菌酶相比，其分子量高，由223個氨基酸組成，其氨基酸組成見表1，與動物溶菌酶相比，木瓜溶菌酶的脯氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的含量非常高。在N末端氨基酸的排列是：甘氨酸—異亮氨酸—絲氨酸—異亮氨酸。C末端氨基酸的排列是：絲氨酸—苯丙氨酸—甘氨酸。木瓜蛋白酶的高級結構，用圓二色性法測定，單環的含量約占30%。光譜測定和化學試劑反應顯示：色氨酸殘基全部埋在酶分子內部，不參與N-乙酰葡糖胺的結合及活性反應。木瓜溶菌酶含有8個半胱氨酸，其中4個形成二硫鍵，4個為游離的SH基，有一個SH基為酶活性中心所必需，木瓜溶菌酶的活性部位結構和雞蛋清、人溶菌酶很不相同（船津勝等，1982）。

表1 植物溶菌酶和雞蛋溶菌酶氨基酸的組成

3 木瓜蛋白酶的性質

3.1 木瓜蛋白酶和木瓜凝乳蛋白酶的性質

木瓜蛋白酶類在結構上的相似性決定了它們在性質上也具有很大的相似性。木瓜蛋白酶和木瓜凝乳蛋白酶都具有廣泛的底物專一性，大多數肽鍵都能被木瓜蛋白酶一定程度地水解，但不同肽鍵被水解的速率相差較大，有的可相差三個數量級；許多氨基酸衍生物及多肽均可作用底物，其中，精氨酸衍生物對水解特別敏感。但木瓜蛋白酶切斷各種鍵的速度比木瓜凝乳酶要快很多。Jansen等(1941)報道，木瓜凝乳蛋白酶水解酪蛋白的速度只有木瓜蛋白酶的一半。Ebara和Yasunobue用木瓜凝乳蛋白酶水解氧化型胰島素（用過鉀酸氧化）的β鏈，指出該酶的優點是能水解含有酸性氨基酸殘基及芳香族氨基酸殘基的肽鍵。在研究胰島素的A鏈及B鏈時，以及對幾種不同長度的含谷氨酰的肽段進行研究時，Layle也注意到木瓜凝乳蛋白酶的優點是水解含谷氨酰的肽鍵。值得一提的是，木瓜凝乳蛋白酶在有機溶劑介質中比在水介質中具有更廣泛的底物特異性（Jin-Eon So等，2000）。

木瓜蛋白酶和木瓜凝乳蛋白酶還可以水解酰胺鍵和酯鍵（凌興漢等，1998）。可催化寡肽的合成，但會有多種副產物,這可能是由于酶的S1位點的廣泛底物專一性造成的（Jin-Eon So等，2000）。

木瓜蛋白酶和木瓜凝乳蛋白酶的最適pH值隨底物不同而不同，木瓜凝乳蛋白酶以酪蛋白為底物,最適反應溫度為80℃（pH值7.0），最適pH值為3～5(37℃)。米氏常數Km值為1.25 g/l(在pH值7.0、反應溫度為37℃的條件下)(Zucker等，1985)。木瓜蛋白酶的最適pH值7.0，pH值穩定性在4～9，60℃以下酶活力穩定，90℃內還有一定的活力。由于其耐熱性高、穩定性好，適合于飼料加工。

PCMD、對氯苯汞甲酸、碘乙酰胺、碘乙酸、過氧化氫、NEM 以及重金屬，如 Hg2+、Ag+、Cu2+、Zn2+等均能不可逆地抑制酶的活性，木瓜凝乳蛋白酶因為含有2個自由巰基，更易被氧化劑氧化或與重金屬離子結合而失活，而在各種各樣的還原物質（半胱氨酸、巰基乙醇、谷胱甘肽、DTT等），并有一些金屬螯合劑（EDTA）作補充時，均能還原其活性中心的半胱氨酸殘基而對酶活性產生激活作用（鄧靜等，2004）。

3.2 木瓜溶菌酶的性質

溶菌酶是一種能夠切斷N-乙酰牧氨酸和N-乙酰葡聚糖胺之間的β-1,4-鍵的酶。木瓜溶菌酶是一種等電點為10.5的堿性蛋白質，對溶壁微球菌的活性只有雞蛋清溶菌酶活性的1/3，最適pH值為4.5，最適的離子強度為0.04～0.07。分解細胞壁時，與動物源溶菌酶相同，在還原末端生成N-乙酰牧氨酸。木瓜溶菌酶對甲殼質的分解活性很高。例如，對膠狀甲殼質的分解活性為雞蛋清溶菌酶活性的10倍，對（N-乙酰葡糖胺）4的分解活性為雞蛋清溶菌酶活性的200倍。該酶分解（N-乙酰葡糖胺）5的產物是（N-乙酰葡糖胺）3和（N-乙酰葡糖胺）2。N-乙酰葡糖胺不呈游離狀態，幾乎見不到糖的移轉反應（So等，2000）。

4 酶活力的測定

4.1 木瓜蛋白酶活力的測定

木瓜蛋白酶活性的測定，是用酶在設定條件下（如一定溫度、一定pH值），對底物蛋白質水解催化反應能力作為酶活性單位的。指酶對蛋白質水解后生成的氨基酸多少而定，在相同條件下，水解生成氨基酸越多，證明酶催化反應能力越大，酶活力越高。

木瓜蛋白酶的活力測定方法有三種：以酪蛋白為底物的紫外分光光度法、茚三酮顯色法及BAEE(苯甲酰-L-精氨酸-乙酯)法。三種方法各有特點。以酪蛋白為底物的紫外分光光度法操作簡便，成本低，適于酶純化過程中的活性比較、木瓜蛋白酶系列產品及食品酶的活性測定；茚三酮顯色法雖操作繁瑣，但所需儀器簡單，在條件簡陋的地區也可以用來測定木瓜蛋白酶的活性；BAEE法反應穩定，重復性好，適于酶學性質的理論研究和試劑酶的活性測定(吳顯榮，2005)。美國藥典和我國藥品標準中規定的木瓜蛋白酶活力測定方法是采用以酪蛋白為底物的紫外分光光度法（羅遠秀，2000；陳德梅等，2004）。

采用紫外分光光度法檢測酶活性，其活性單位定義是：在測定條件下，每分鐘水解酪蛋白釋放出的三氯乙酸可溶物，在波長為275 nm時的消光值相當于濃度為1 μg/ml的酪氨酸消光值時，所需要的酶量，為一個酶活力單位。

采用該法測定有幾個需要注意的問題：①三氯乙酸濃度不同，測定酶活力的結果就不同。②不同產地的酪蛋白，所測定的木瓜蛋白酶活性有明顯差異，進口的酪蛋白溶解度好，所測酶活力較高。③要在最佳pH值條件下測定（趙元藩等，1999）。

4.2 木瓜凝乳蛋白酶活力的測定

木瓜凝乳蛋白酶水解活力的測定方法采用以酪蛋白為底物的紫外分光光度法。該酶與木瓜蛋白酶相比還具有凝乳活性，凝乳活性單位定義是以40 min內凝固1 ml 10%脫脂乳（含0.01 mol/l CaCl2）的酶量定義為一個酶活力單位，即一個索氏單位（Soxhlet Unit），以相對活力（RU）表示各因素的影響效果（Arima等，1967）。

4.3 木瓜溶菌酶活力測定

溶菌酶活力的測定方法通常有3種。

①以細胞壁作為底物，用作用前后濁度的變化表示酶活力的大小。

②以溶壁小球菌培養液作為底物，用作用前后濁度的變化表示酶活力的大小。

由于上述兩種方法都是用固液兩相反應，難以準確測定反應速度，故有人將水溶性多糖己二醇甲殼質制備均勻態底物，用來測定酶活力。

③分光光度計測定法，在450 nm處，把一定量的菌體凍干粉或冰浴解凍的溶壁微球菌液溶解于一定量的磷酸鹽緩沖液中，使吸光度值在1.3左右，此底物溶液以及標準酶液在溫度25℃水浴中保溫。用1 cm比色皿裝2.5 ml底物于水浴中，加入0.5 ml酶液開始計時，記下反應1 min時的讀數E1以及反應2 min時的讀數E2，用公式計算出酶活力。不同酶活的標準酶液對應不同的△E，而據此△E又可算出所用標準酶的酶活，從而可驗證檢測的準確性（張勇，2004）。

5 木瓜蛋白酶的固定化

固定化酶是20世紀60年代發展起來的一項新技術。所謂固定化是指利用物理或化學手段將游離的細胞或酶與固態的不溶性載體相結合，使其保持活性并可反復使用的一種技術。為了提高木瓜蛋白酶的使用效率，降低生產成本，國內外研究人員對木瓜蛋白酶的固定化及其應用進行了許多研究。

1961年J.Cebray就成功地將木瓜蛋白酶固定在多聚氨基酸載體上，并利用它來水解制備γ－球蛋白的片段。1977年美國J.W.Finley采用戊二醛交聯法，將木瓜蛋白酶固定在幾丁質上，并用于啤酒生產過程，取得較好的防濁效果。1978年，法國P.Monsan等用氨基烷化微孔玻璃作為載體，將木瓜蛋白酶交聯在上面，也應用于啤酒的澄清（凌興漢等，1998）。徐鳳彩等(1992)分別用甘蔗渣纖維素、尼龍為載體固定木瓜蛋白酶，測定了固定化酶的酶學性質并應用于啤酒的澄清。李紅等（2001）用殼聚糖微球固定木瓜蛋白酶，研究了固定化酶的酶學特性并應用于酪蛋白水解制備酪氨酸。而筆者也先后在這方面開展了系列工作，包括用家蠶等絲素固定木瓜蛋白酶，研究了固定化酶的酶學特性并應用于酪蛋白水解制備酪氨酸，以及絲素固定化木瓜蛋白酶填充床反應器及其應用，均取得了較理想的效果（陳芳艷等，2004、2005a、2005b），并獲得了相應的木瓜蛋白酶的固定化產品。

6 木瓜蛋白酶在飼料工業中的應用

在食品加工過程中，會產生大量的蛋白質下腳料，如動物的羽毛、屠宰后的動物血液、魚類加工產生的魚排、魚頭等，這些蛋白質直接打粉加工成飼料，動物難以消化吸收，棄之不僅是資源的浪費，而且會污染環境。利用蛋白酶將其水解成可溶性的小分子蛋白質及氨基酸，易于動物的吸收利用，不僅可以開發出價廉質高的蛋白飼料，而且可提高日糧的利用率，降低飼料成本（呂世民等，2001；譚艾娟等，1998；楊萍等，2008）。目前用動物蛋白酶水解價格太昂貴；微生物發酵方法進行加工，易受雜菌污染和易含毒；而木瓜蛋白酶活力強、耐熱性高、穩定性好，可用于飼料加工。

此外，木瓜蛋白酶作為添加劑加入畜禽日糧中可幫助飼料消化、提高飼料的效價，減少飼用量，使禽畜生長率提高，同時對奶牛的增乳、提高奶質以及預防乳腺炎等有顯著功效。

張慶等（1996）在對蝦飼料中添加了0.3%的木瓜蛋白酶，對生產過程中木瓜蛋白酶的活性變化及在養殖中的效果作了研究，指出在對蝦飼料生產條件下（85℃、時間 45 min）木瓜蛋白酶的活力損失會很嚴重。而在禽畜料生產條件下（溫度75℃），蛋白酶活力保存得相當好。因此，在制粒條件下，要保存大部分酶活力的溫度只能在75℃左右。在對蝦養殖中顯示有一定的促生長效果，可提高產量5%。

賓石玉等（1996）在生長豬日糧中添加0.1%的木瓜蛋白酶，對生長豬的日增重和飼料轉化率均有提高，以10～20 kg的生長豬效果最顯著(P＜0.01)。研究結果表明，在生長前期的生長豬日糧中添加木瓜蛋白酶最為適宜，生長中期也可適量使用。

何霆等（1992）在日糧中添加木瓜蛋白酶(4萬單位/kg飼料)飼養肉用仔雞。研究結果顯示，雖然添加木瓜蛋白酶的肉仔雞平均增重差異不顯著 (P＞0.05)，但飼料消耗各試驗組均比對照組稍偏低，而且日糧中使用FS蛋白飼料(發酵血粉)的比魚粉效果更好，究其原因FS蛋白飼料中除含有動物血液外，還有多種含植物纖維的餅粕類載體，可能是木瓜蛋白酶中的其他一些酶類也發揮作用。

7 結束語

木瓜蛋白酶是純天然產物，并具有較強的蛋白酶水解和合成能力，還具有凝乳、解脂和溶菌活力，用途十分廣泛。目前世界木瓜蛋白酶的應用比例為：釀造和飲料業占75%、肉類加工業10%、魚類加工業5%、制藥業3%、飼料加工業5%、其他領域為占2%。可見，木瓜蛋白酶在飼料工業中的應用比例相對較少，具有更大的應用空間。究其原因可能是：該酶在飼料加工過程中成本相對較高，酶活力損失過大，限制了其應用；或者作為飼料添加劑，在飼養的過程中沒有科學的使用該酶。因此，如何能更有效、更長久地提高和保持木瓜蛋白酶的活性；如何在不同動物品種、不同飼養階段正確、合理地使用該酶來發揮作用是今后值得投入研究開發的重點。

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