電針對慢性內臟痛敏大鼠延髓頭端腹內側核NMDA-R1受體表達的影響

祁德波,李為民

?

電針對慢性內臟痛敏大鼠延髓頭端腹內側核NMDA-R1受體表達的影響

祁德波1,李為民2

(1.復旦大學力學與工程科學系,上海 200433;2.復旦大學上海醫學院神經網絡系統生物學實驗室，上海 200032)

在電針(EA)緩解腸易激綜合征(IBS)模型大鼠慢性內臟痛敏基礎上,觀察電針處理對IBS模型大鼠延髓頭端腹內側核(RVM)N-甲基-D-門冬氨酸1型(NMDA-R1)受體表達的影響。將新生9 d SD幼鼠分為兩組,第一組通過結直腸機械擴張刺激制作IBS慢性內臟痛敏模型,持續兩星期;另一組僅輕柔肛周皮膚作為對照。飼養至6～8星期后,分別觀察兩組大鼠由結直腸擴張(CRD)誘發的腹部撤回反射(AWR)評分和痛閾壓力值(PTP)變化。繼而隨機將IBS模型大鼠分為模型組(M)、模型加電針組(EA)和模型加假電針組(SEA)。模型組不做任何治療,電針組穴位取雙側“足三里”和“上巨虛”,連續隔日治療4次,假電針不通電,余與電針組同。治療結束后,取材并用免疫組化方法觀察各組大鼠RVM中NMDA-R1受體表達變化。成年IBS大鼠AWR評分明顯升高(＜0.01),PTP值明顯降低(＜0.01);電針可以明顯降低AWR評分(＜0.05),并使PTP值明顯升高(＜0.01);假電針則沒有此作用。IBS大鼠RVM中NMDA-R1受體陽性神經元數目和積分光密度明顯高于正常對照大鼠(＜0.05);而電針可使其表達明顯降低(＜0.05);假電針則沒有這樣的作用。電針對IBS大鼠的慢性內臟痛敏具有良好的治療作用,其作用機制可能通過調節腦內RVM中NMDA-R1受體表達來發揮的。

針刺;電針;慢性內臟痛敏;大鼠

內臟感覺異常是腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)患者出現慢性內臟痛敏(chronic visceral hyperalgesia)現象的主要機制之一[1,2],而反復發作的腹痛是IBS患者頻繁就醫的重要原因。至今,對于IBS的治療仍無有效的方法,而IBS的治療耗費了大量醫療和社會資源[3,4],因此尋找有效和經濟的治療方法已成為一種必然趨勢。

針刺鎮痛在中醫學中已有數千年的歷史,并且現今仍活躍應用于臨床實踐。相對于藥物治療,針刺治療某些疾病具有療效確切、操作簡便、經濟實用、副反應少等優點。自上世紀70年代以來,針刺對慢性內臟痛的良好療效[5-8]受到了國內外的持續關注,但針刺緩解內臟痛的機制不明,還有待進一步的研究。

Al-Chaer[9]于2001年報道了一種能夠模擬臨床IBS內臟痛敏的大鼠模型。我們在成功復制了該IBS模型大鼠后,觀察了電針對腸易激綜合征的治療作用,結果發現電針能明顯緩解模型大鼠慢性內臟痛敏并可能是通過NMDA受體發揮作用的[10-12],然而目前對于針刺治療IBS模型大鼠慢性內臟痛敏作用的機制研究還有待于進一步的開展。鑒于慢性內臟痛的形成和發展與延髓頭端腹內側核(rostral ventromedial medulla, RVM)中谷氨酸遞質受體系統有著密切聯系[13-16],本研究選擇了RVM中NMDA-R1受體為研究對象,觀察和分析NMDA-R1受體在針刺緩解IBS模型大鼠慢性內臟痛敏中的參與機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性Sprague-Dawley(SD)新生大鼠(出生后5 d),由中科院上海實驗動物中心提供。每窩幼鼠與1只雌性哺乳大鼠共同飼養在1個塑料籠內,哺乳大鼠自由飲食,飼養環境為12 h～12 h晝夜節律變換,室溫控制在18～24℃,濕度控制在50%～70%。飼養3 d后用于實驗。實驗時室溫維持在20～24℃。所有對動物的實驗處理符合國際疼痛研究會制定的準則。

1.2 IBS慢性內臟痛敏模型制作

IBS模型制作方法如前我們文章所述[10,12,17],新生的SD雄性大鼠自出生后9 d起,在清醒狀態下,使用自制的刺激球囊,蘸少許甘油,自肛門輕柔插入,深度2 cm,大致達到大鼠的降結腸部位。球囊充氣0.2 mL,持續1 min,然后撤氣,緩慢抽出刺激球囊。30 min后,重復一次同樣的刺激。1 d內給予以上操作1次,連續2星期。正常對照組大鼠是將新生乳鼠與IBS造模鼠一起飼養,只用球囊輕揉肛周皮膚,但不做球囊擴張刺激。造模結束后,飼養大鼠至6～8周齡,體重達到200～250 g時,進行下一步的實驗。動物隨機分為正常對照組(N),模型組(M),模型加電針組(EA)和模型加假電針組(SEA),每組8只。

1.3 腹部撤回反射(AWR)評分

大鼠飼養6～8星期后,對大鼠進行結直腸擴張刺激(colorectal distension,CRD),觀察腹部撤回反射(abdominal withdraw reflex,AWR)評分。于清醒狀態下從大鼠肛門置入擴張球囊,深度為6 cm,并置大鼠于平臺上,限制其于一20 cm×8 cm×8 cm透明塑料盒內,讓大鼠適應15～20 min后進行CRD刺激和AWR評分。開始正式實驗前,將連接臺式血壓計和一個10 mL注射器的三通管與大鼠球囊相接,后分別給予20、40、60、80 mmHg四個不同壓力分級的CRD刺激。每次CRD刺激持續20 s,間隔5 min后給下一次刺激;每個刺激強度重復3次,取觀察指標AWR評分的平均值作為每次最后的評分值。相應的評分標準參照Al-Chaer的方法和我們的改進[9,10,17],即對CRD無行為反應,評為0分;給予刺激大鼠有頭部或軀體動作短暫停頓,評為1分;刺激期間,見有腹部肌肉的收縮,評為2分;如有腹部抬起行為,評為3分;身體拱起,并抬起盆腔和陰囊者,評為4分。

1.4 痛閾壓力值(PTP)測定

痛閾壓力值(pain threshold pressure,PTP)測定前準備工作與AWR評分相同。CRD刺激以5 mmHg的間隔逐級增加,當大鼠腹壁出現收縮時的壓力值即為PTP值,然后迅速撤氣。間隔5 min后給下一次刺激;每個刺激強度重復5次,取觀察指標PTP平均值作為每次最后的評分值。

1.5 選穴和電針參數

電針穴位取雙側“足三里”和“上巨虛”。電針治療儀為華佗牌電針儀(SDZ-IV型),采用疏密波(密波頻率5～100 Hz可調,疏波頻率是密波頻率的1/5,疏波時間為5 s,密波時間為10 s),以動物下肢發生輕度抖動為宜,共持續30 min,隔日治療1次。假電針組不通電,余與治療組同。在第4次電針治療后第2天對大鼠進行CRD刺激,對AWR變化評分,評估電針的治療作用。

1.6 固定和冰凍切片的制備

大鼠在5%戊巴比妥麻醉下,迅速打開胸腔,暴露心臟,經左心室插管至升主動脈,剪開右心耳。快速灌入預冷的生理鹽水300 mL沖洗,隨后換用4%多聚甲醛(pH 7.4)300 mL,約30 min內灌注完畢。鉗斷大鼠顱骨,取出延髓(RVM取材部位及橫截面示意圖見Fig.1[18]),放入含20%蔗糖的4%多聚甲醛液中固定24 h后,再浸入30%蔗糖磷酸緩沖液保存,后將其制成30mm連續冰凍切片(CM-1900恒冷切片機,德國徠卡公司),分別置于不同標記的24孔板中。

1.7 免疫組織化學檢測

先將切片置于羊血清中室溫下孵育30 min,再將切片浸于兔抗大鼠NMDA-R1抗體(武漢博士德公司,工作濃度1:100)溶液中,4℃放置48 h,然后相繼用羊抗兔生物素化二抗和HRP標記鏈親和素(SABC免疫組化試劑盒,武漢博士德公司)室溫中各孵育30 min,DAB顯色(DAB試劑盒,武漢博士德公司),無水乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。分別用正常羊血清代替一抗和省略一抗作陰性對照。每只大鼠取3張切片,對NMDA-R1受體免疫陽性細胞進行計數,取算術平均值;每只大鼠取3張切片,每張切片取5個視野,用Image Pro Plus(IPP)軟件計算積分光密度(integrated optical density,IOD)。

1.8 統計學方法

數據均以平均值±標準誤(Mean±SEM)表示。用SPSS13.0統計軟件進行統計學分析,多組間的比較采用單因素方差分析,并用SNK進行兩兩比較。以＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 IBS模型大鼠與正常大鼠PTP值及AWR評分比較

由表1可見,與正常對照組比較,模型組的PTP值明顯下降(＜0.01)。AWR評分結果顯示,在不同強度(20、40、60、80 mmHg)的CRD誘發內臟痛刺激下,模型組相比于正常對照組,AWR評分明顯升高(＜0.05)。

2.2 電針組與假電針組治療前后PTP值及AWR評分比較

由表2可見,電針組治療后與治療前及假電針組治療后相比,AWR評分明顯降低(＜0.05),PTP明顯升高(＜0.01),而假電針組治療后與治療前AWR評分的差異無統計學意義(＞0.05)。

2.3 各組RVM中NMDA-R1受體表達比較

由表3可見,模型組NMDA-R1受體免疫陽性細胞的計數和IOD與正常對照組相比明顯升高(＜0.05),而電針組NMDA-R1受體免疫陽性細胞的計數和IOD明顯下降(＜0.05),但假電針組與模型組相比無明顯變化(＞0.05)。

表1 IBS模型大鼠與正常大鼠PTP值及AWR評分比較

表2 電針組與假電針組治療前后PTP值及AWR評分比較

注:與同組治療前比較1)＜0.01,2)＜0.05;與假電針組比較3)＜0.05

表3 各組RVM中NMDA-R1受體表達比較

注:與正常對照組比較1)＜0.05;與模型組比較2)＜0.05

3 討論

內臟痛敏是IBS患者主要臨床癥狀之一,嚴重影響著他們的生活質量。有研究表明,幼年和童年時期受到身體、言語、性等方面的虐待所造成的心理創傷,改變了中樞神經系統可塑性,這可能與成年后IBS內臟痛敏的發病密切相關[19]。大鼠在新生期受到結直腸炎癥[9,20]、機械擴張[9-12]等傷害刺激,以及母嬰分離[21]等精神因素困擾,可使大鼠成年后機體產生內臟痛覺超敏(allodynia)和痛覺過敏(hyperalgesia)狀態,前者為對正常狀態下非傷害性刺激產生疼痛反應,后者為對傷害性刺激產生的疼痛反應增強。

如前所述,本研究中的模型大鼠在出生后9～21 d,每天給予大鼠結直腸擴張刺激,恢復2星期后,行為學測試結果表明,成年模型大鼠明顯處于痛覺超敏和痛覺過敏狀態。PTP數據顯示,IBS模型大鼠的痛閾值明顯下降;IBS模型大鼠在20 mmHg(非傷害性),40、60、80 mmHg(傷害性)CRD刺激時AWR評分明顯高于正常對照組。這表明于出生早期給予連續傷害性機械刺激,可誘發動物持續至成年的痛覺過敏,能較好地模擬IBS的臨床表現。

延髓頭端腹內側核(RVM)是脊髓上神經中樞對內臟傷害刺激進行下行調制的共同通路。RVM對內臟痛具有雙重調節作用,抑制和易化傷害輸入。根據大量研究成果,Porreca等[21]提出假設,RVM對于疼痛信息的下行調節功能紊亂,可能是疼痛感覺異常如IBS,纖維肌痛和神經性疼痛的重要原因,而RVM中谷氨酸遞質及其受體,特別是NMDA受體,在內臟痛敏的調節中發揮了重要作用[13-16]。本研究的免疫組化結果顯示,模型組大鼠與正常對照組大鼠相比,NMDA-R1受免疫陽性細胞的計數和IOD與正常對照組相比明顯升高,這表明RVM中NMDA-R1受體表達升高,是IBS模型大鼠內臟痛敏現象發生的重要原因。

本研究在成功制作了IBS大鼠模型后,重新驗證了電針對模型大鼠的作用。研究顯示,隔日電針治療4次后,發現電針治療組AWR評分明顯下降,PTP值明顯上升,而假電針則無此效應,這顯示電針能明顯緩解模型大鼠的內臟痛癥狀。我們在電針治療之后通過免疫組織化學方法來觀察電針對RVM NMDA-R1受體表達的影響,以探討電針緩解內臟痛的神經生物學機制。實驗顯示,電針可以下調NMDA-R1受體的表達,而電針可能通過下調RVM中NMDA-R1受體的表達來實現其治療作用。

[1] Verne G N, Robinson M E, Price D D. Hypersensitivity to visceral and cutaneous pain in the irritable bowel syndrome[J]. Pain, 2001,93 (1):7-14.

[2] Sengupta J N. Visceral pain: the neurophysiological mechanism[J]. Handb Exp Pharmacol, 2009,(194):31-74.

[3] Talley N J, Gabriel S E, Harmsen W S,. Medical costs in community subjects with irritable bowel syndrome[J]. Gastroen- terology, 1995,109(6):1736-1741.

[4] Cash B, Sullivan S, Barghout V. Total costs of IBS: employer and managed care perspective[J]. Am J Manag Care, 2005,11(1):S7 -S16.

[5] Xiao W B, Liu Y L. Rectal hypersensitivity reduced by acupoint TENS in patients with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome: a pilot study[J]. Dig Dis Sci, 2004,49(2):312-319.

[6] Schneider A, Weiland C, Enck P,. Neuroendocrinological effects of acupuncture treatment in patients with irritable bowel syndrome[J]. Complement Ther Med, 2007,15(4):255-263.

[7] Huang Lechun, Li Junxiong. Clinical Study on the Treatment of Renal Colic by Body and Auricular Acupuncture[J]. J Acupunct Tuina Sci,2011,9(2):104-106.

[8] Chen Yun, Liu Guangxia. Clinical Study on Treatment of Biliary Colic with Midnight-Noon Ebb-Flow Day-Prescription of Acupoints [J]. J Acupunct Tuina Sci, 2011,9(2):101-103.

[9] Al-Chaer E D, Kawasaki M, Pasricha P J. A new model of chronic visceral hypersensitivity in adult rats induced by colon irritation during postnatal development[J]. Gastroenterology, 2000,119(5): 1276-1285.

[10] Cui K M, Li W M, Gao X,. Electro-acupuncture relieves chronic visceral hyperalgesia in rats[J]. Neurosci Lett, 2005,376(1):20-23.

[11]李為民,崔可密,吳根誠.電針治療腸易激綜合征大鼠作用觀察 [J].上海針灸雜志,2006,25(3):43-47.

[11]周娟,李為民.電針對腸易激綜合征大鼠脊髓NMDA受體表達的影響 [J].上海針灸雜志,2008,27(6):38-40.

[12] Coutinho S V, Urban M O, Gebhart G F. Role of glutamate receptors and nitric oxide in the rostral ventromedial medulla in visceral hyper- algesia[J]. Pain, 1998,78(1):59-69.

[13] Zhuo M, Sengupta J N, Gebhart G F. Biphasic modulation of spinal visceral nociceptive transmission from the rostroventral medial medu- lla in the rat[J]. J Neurophysiol, 2002,87(5):2225-2236.

[14] Coutinho S V, Urban M O, Gebhart G F. The role of CNS NMDA receptors and nitric oxide in visceral hyperalgesia[J]. Eur J Pharmacol, 2001,429(1-3):319-325.

[15] Zhuo M, Gebhart G F. Facilitation and attenuation of a visceral nociceptive reflex from the rostroventral medulla in the rat[J]. Gastroenterology, 2002,122(4):1007-1019.

[16]王智君,李為民.電針對腸易激綜合征大鼠腸道運動異常的調節作用[J].中西醫結合學報,2010,8(9):883-887.

[17] George P, Charles W. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Compact 6th Edition[M]. Elsevier Inc, 2007:270-298.

[18] Drossman D A. Chronic functional abdominal pain[J]. Am J Gastroen- terol, 1996,91(11):2270-2281.

[19] Winston J, Shenoy M, Medley D,. The vanilloid receptor initiates and maintains colonic hypersensitivity induced by neonatal colon irritation in rats[J]. Gastroenterology, 2007,132(2):615-627.

[20] Chung E K, Bian Z X, Xu H X,. Neonatal maternal separation increases brain-derived neurotrophic factor and tyrosine kinase receptor B expression in the descending pain modulatory system[J]. Neurosignals, 2009,17(3):213-321.

[21] Porreca F, Ossipov M H, Gebhart G F. Chronic pain and medullary descending facilitation[J]. Trends Neurosci, 2002,25(6):319-325.

Effect of Electroacupuncture on Expression of NMDA-R1 Receptor in the Rostral Ventromedia Medulla of Rats with Chronic Visceral Hyperalgesia

-1,-2.

1.,,200433,; 2.,200032,

To investigate the effect of electroacupuncture (EA) on the expression of N-methyl-D-aspartate receptor 1 (NMDA-R1) in the rostral ventromedia medulla (RVM) on the basis of EA relieving chronic visceral hyperalgesia in a rat model of irritable bowel syndrome (IBS).Nine-day-old SD rats were allocated to two groups. In one group, a model of IBS chronic visceral hyperalgesia was made by 2 weeks’ mechanical dilation of colorectum. In the other group as a control, perianal skin was kneaded lightly. Colorectal distention (CRD)-induced abdominal withdraw reflex (AWR) was scored and pain threshold pressure (PTP) was measured in the two groups at 6-8 weeks after feeding. Then, IBS rats were randomly allocated to model, electroacupuncture and sham electroacupuncture groups. The model group was not given treatment. In the electroacupuncture group, bilateral points Zusanli and Shangjuxu were selected and treatment was given once every other day for 4 times. The sham electroacupuncture group was given the same treatment as in the electroacupuncture group except no electrification. After treatment was finished, the specimen was taken and the expression of NMDA-R1 in RVM was examined by an immunohistochemical method in each group of rats.The AWR score increased significantly (＜0.01) and PTP decreased significantly (＜0.01) in the adult IBS rats. Electroacupuncture increased the AWR score significantly (＜0.05) and decreased PTP significantly (＜0.01). Sham electroacupuncture had no such effects. The number and integrated optical density of RVM NMDA-R1-positive neurons were significantly higher in the IBS rats than in the normal control rats (＜0.05). Electroacupuncture increased its expression significantly (＜0.05). Sham electroacupuncture had no such effect.Electroacupuncture has a good therapeutic effect on chronic visceral hyperalgesia in IBS rats. The mechanism of its action may be that it regulates the expression of NMDA-R1 in RVM.

Acupuncture; Electroacupuncture; Chronic visceral hyperalgesia; Rats;NMDA-R1receptor expression

1005-0957(2011)07-0491-04

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2011.07.490

2011-04-20

祁德波(1983 - ),男,2008 級碩士生

李為民(1959 - ),男,教授,博士生導師,研究方向為針刺效應的神經生物學機制及其復雜網絡系統,植物神經功能調控機制,E-mail:wmli9110@fudan.edu.cn