一種純化蘇云金桿菌Cry1Ac蛋白的方法

王發祥，劉永樂，丁學知，夏立秋

（1.長沙理工大學化學與生物工程學院，長沙 410114；2.湖南師范大學生命科學學院微生物分子生物學湖南省重點實驗室，長沙 410081)

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt）是世界上應用范圍最廣的殺蟲微生物，其殺蟲活性主要來源于芽胞形成過程中產生的殺蟲晶體蛋白。蘇云金桿菌毒蛋白的殺蟲機理已基本明確，描述如下：晶體蛋白被敏感昆蟲吞食后，在堿性的中腸環境中很快被蛋白酶激活為活性毒素，然后結合到中腸上皮細胞的特異受體上，毒素隨后發生構象變化并插入中腸膜，形成離子通道的孔，暴露在毒素中的中腸上皮細胞由于滲透平衡破壞而最終裂解死亡，并導致蟲體的死亡[1-2]。目前，對蘇云金桿菌Cry毒蛋白的結構與功能研究已成為一個熱點，但國內在相關領域的研究，受Cry蛋白的純化技術的制約，遠落后于國際水平。

Cry蛋白是蘇云金桿菌在芽胞形成期產生的一種伴胞晶體蛋白，只有活化后才具有特異的殺蟲活性，其原毒素通常和20 kb DNA結合在一起[3]，因此很難用分子篩層析純化。另外，我們發現，用離子交換層析也無法純化獲得Cry蛋白原毒素，這很可能與Cry蛋白和20 kb DNA分子表面電荷分布復雜有關。基于此，我們提出了一種以等電點沉淀法純化Cry1Ac蛋白原毒素，進而用分子篩層析純化其活性的毒素片段的方法，為進一步研究Cry蛋白的結構和功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

BH-2型顯微鏡（日本Olympus公司）；AKTA purifier 100 system（美國 GE Healthcare）；DYY－Ⅲ－6B型電泳儀（北京六一儀器廠）；EY-1型超聲波細胞粉碎機（寧波新芝科器研究所）。

胰蛋白酶（trypsin）、苯甲基磺酰氟（PMSF）和二硫蘇糖醇（DTT）均購自美國Amresco公司；其它試劑均為國產或進口分裝分析純。

1.2 質粒和菌株

質粒pHTAc35[4]為含有cry1Ac5（Genbank登錄號：M73248）全長的pHT315重組質粒，由本室構建；菌株BUAcHT35[4]為含有質粒pHTAc35的 Cry-B重組菌，產典型菱形晶體，為本室構建保存。

1.3 液體雙相法提純伴孢晶體

將菌株BUAcHT35接種于G-tris培養基中，28℃，200 r/min培養至晶體和芽胞從母體細胞中完全釋放。收集發酵液，10 000 r/min離心10 min，沉淀，用0.5 mol/L NaCl洗滌3次，以生理鹽水制成懸液，超聲波處理（工作 30 s，間隙 30 s，20次），使晶體、芽胞、細胞碎片盡量分散；10 000 r/min離心10 min，收集沉淀，以生理鹽水洗滌2次；然后制成濃度為70 mg/mL（沉淀/雙蒸水）的懸液，用磁力攪拌器反復攪勻，同時不停地除去產生的泡沫，當懸液中的泡沫不再增加時，轉入分液漏斗，按7∶6∶7的比例分別加入1%Na2SO4和CCl4，充分振蕩10 min后，靜置10 min；吸出上層水相，10 000 r/min離心10 min，沉淀用5%丙酮和雙蒸水各洗滌3次，所得沉淀即為提純的伴孢晶體，凍干備用。

1.4 等電點沉淀法純化原毒素

稱取10 mg凍干的晶體，加入10 mL 50 mmol/L 的 Na2CO3/NaHCO3緩沖液（pH 值 10.5），100 μL 100 mmol/L的DTT和終濃度為10 mmol/L的PMSF，4℃溶解 5 h后 12 000 r/min離心 1 min，棄不溶物；上清液用2 mol/L的醋酸/醋酸鈉緩沖液（pH 值 4.0） 調節 pH 值分別至 4.55、4.65、4.75、4.85、4.95、5.05，置于 4℃環境下沉淀過夜，離心（13 200 r/min，10 min）收集沉淀，重懸浮于等量50 mmol/L的Na2CO3/NaHCO3（pH值9.5）緩沖液中，進行SDS-PAGE分析。

1.5 分子篩層析純化核心毒素

上述等電點沉淀純化的原毒素，加入500 μL 50 mmol/L的Na2CO3/NaHCO3緩沖液（pH值9.5）重懸浮，超聲波處理5s后按體積比50∶1加入10 μg/μL胰蛋白酶，37℃振蕩1～2 h；然后在 AKTA purifier 100純化系統中以superdex 200分子篩層析柱進行層析純化，洗脫液為50 mmol/L的Na2CO3/NaHCO3（pH值10.5），洗脫流速為0.5 mL/min，上樣體積為0.5 mL，收集主要的峰部分進行SDS-PAGE檢測，目的峰收集部分即為純化的毒素核心片段。

2 結果與分析

2.1 Cry1Ac5原毒素的純化

Cry1Ac5蛋白的理論等電點（pI）為5.05，為了確定實際操作中Cry1Ac蛋白的真實等電點，將晶體溶解后調成系列pH值，用SDS-PAGE分析所得沉淀和上清液，結果如圖1。

圖1 不同的pH值下Cry1Ac原毒素的純化效果

如圖1所示，在pH值4.65～5.15，沉淀中都含有130 kDa蛋白條帶，而上清液中則沒有檢測到相應條帶，說明在該pH值范圍，原毒素都會沉淀，且隨著pH值上升，沉淀中檢測到的130 kDa蛋白信號逐漸加強，pH值5.05時，蛋白條帶最粗，因此5.05應為Cry1Ac3蛋白原毒素等電點沉淀的最佳pH值，與其理論等電點一致。此外，以等電點沉淀法純化的原毒素幾乎沒有雜蛋白，純化效果較好，但與晶體溶解后的上清液相比，其蛋白含量有較大的損失。

2.2 分子篩層析純化毒素活性片段

將等電點沉淀的原毒素以胰蛋白酶活化后，以AKTA purifier 100純化系統進行分子篩層析，如層析圖譜（圖2A）所示，在洗脫時間15 min和30 min時，有兩個典型的峰，其中第1個峰在波長260 nm下的紫外吸收值大于波長280 nm下的吸收值，可能為結合在晶體蛋白上的DNA；第2個峰在280 nm下的紫外吸收值大于波長260 nm下的吸收值，應該為目的蛋白峰。收集峰1和峰2進行SDSPAGE檢測（圖2B），發現峰1對應的泳道沒有蛋白條帶，后經瓊脂糖電泳證實其主要成分為20kb DNA (數據未列出)，峰2對應的泳道僅有一條60 kDa左右的蛋白條帶，即為活化的毒素核心片段，且純化效果較好。另外，洗脫時間35 min后還出現了一個較大的非典型峰，可能為活化過程中降解成的小分子肽片段，實驗中沒有收集和檢測。

圖2 AKTA purifier 100純化圖譜（A）和SDS-PAGE分析（B）

3 討 論

Cry1Ac毒蛋白是目前所知的對鱗翅目昆蟲毒性最高和研究最多的Bt毒素之一，在農業生產、森林管理及水生態系統中都具有廣泛的應用[5]。目前，在Bt毒素命名委員會網站中公布的Cry1Ac蛋白共23種，即Cry1Ac1～Cry1Ac23，Cry1Ac5為其中一種，含有1177個氨基酸，原毒素理論分子量為133 kDa，被昆蟲吞食后在其中腸中被蛋白酶裂解掉C-端566多個氨基酸和N-端的33個氨基酸，激活為65 kDa左右的核心毒素。目前，Cry1Ac蛋白的三維結構尚未通過晶體衍射法完全明確，但研究發現其結構域Ⅲ比較特殊，與其它所有Cry1類蛋白的親緣關系較遠[6]。研究Cry1Ac蛋白的結構與功能一直是當前的熱點，因而獲得純化的Cry1Ac蛋白尤為重要。

根據不同的研究目的，Cry1Ac蛋白的純化涉及到伴孢晶體、原毒素和活性毒素的純化。伴孢晶體提純可采用液體雙相法和Mg2+梯度離心法[7]等；原毒素由于和20 kb DNA緊密結合，無法以層析等方法純化，目前鮮有純化的相關研究；另外，現有的報道幾乎都是以分子篩層析方法純化活性毒素，但由于大多以晶體溶解液直接活化，純化后還需要用超濾濃縮離心管進行濃縮[8]。本文用液體雙相法提純伴孢晶體后，將其溶解在含有還原劑DTT的Na2CO3/NaHCO3緩沖液（pH 值10.5），調節 pH 值至5.05進行等電點沉淀，獲得純化的原毒素，將其重懸浮于Na2CO3/NaHCO3緩沖液（pH值9.5），用胰蛋白酶激活后進行superdex 200分子篩柱層析，收集其最大峰即為純化的活性毒素。本方法不僅純化效果好，而且對原毒素進行了濃縮，故以此為基礎通過分子篩層析純化的活性毒素可直接用于分析和功能研究實驗，省去了超濾離心濃縮步驟。這是Cry蛋白的純化方法研究中的一次革新，對推動Cry蛋白的結構和功能研究具有重要的意義。

[1] Bravo A,Gill S S,Soberon M.Mode of action of Bacillus thuringiensis Cry and Cyt toxins and their potential for insect control[J].Toxicon,2006,（49）:423-435.

[2] Dean D H,Rajamohan F,Lee M K,et al.Probing the mechanism of action of Bacillus thuringiensis insecticidal proteins by site-directed mutagenesis—a minireview[J].Gene.1996,（179）:111-117.

[3] Xia L Q,Sun Y J,Ding X Z,et al.Identification of cry-type genes on 20-kb DNA associated with Cry1 crystal proteins from Bacillus thuringiensis[J].Curr Microbiol,2005,51（1）:53-8.

[4] Xia L Q,Wang F X,Ding X Z,et al.The role of β18-β19 loop structure in insecticidal activity of Cry1Ac toxin from Bacillus thuringiensis[J].chinese science bulletin.2008,53（20）:3178-3184.

[5] Sarvjeet K.Molecular approaches towards development of novel Bacillus thuringiensis biopesticides[J].World Journal of Microbiology&Biotechnology,2000,（16）:781-793.

[6] De Maagd R A,Bravo A,Crickmore N.How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to colonize the insect world[J].Trends Genet,2001,17（4）:193-9.

[7] Liao C,Heckel D G,Akhurst R.Toxicity of Bacillus thuringiensis insecticidal proteins for Helicoverpa armigera and Helicoverpa punctigera（Lepidoptera:Noctuidae）,major pests of cotton[J].Invertebr Pathol,2002,80（1）:55-63.

[8] Likitvivatanavong S,KatzenmeierG,AngsuthanasombatC.Asn183 in alpha5 is essential for oligomerisation and toxicity of the Bacillus thuringiensis Cry4Ba toxin[J].Arch Biochem Biophys.2006,445（1）:46-55.