內切酶與端肽酶水解牛乳酪蛋白的研究

丁 勇，孔 芳，衣杰榮，包建強

（上海海洋大學食品學院，上海 201306）

牛乳中含有大量的蛋白質，其含量約為牛乳的3.3～3.5%，主要有酪蛋白、乳白蛋白、乳球蛋白、乳鐵蛋白和一些具有重要生理功能的酶類。酪蛋白在牛乳中占蛋白質總量的80%～82%，并且酪蛋白中含有人體必需的8種氨基酸，是一種全價蛋白質（PER值為2.5），能夠為生物體生長發育提供必需的氨基酸。酪蛋白水解后，可離出多種活性物質，按其功能分為：降血壓肽、抗血栓肽、免疫活性肽、促進礦物離子吸收肽、抗菌肽等[1-2]。用酶法水解酪蛋白具有條件緩和、環境適宜和不破壞營養等好處，是蛋白質水解技術開發研究的方向。但在水解后，蛋白質經酶水解得到的多肽往往帶有較明顯的苦味，限制了其在食品中的應用。應用游離的疏水性氨基酸無明顯的苦味的特性，用外切酶將位于端基的疏水性氨基酸殘基切下，可有效的減少水解液中的苦味。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛乳酪蛋白（上海貝基生物科技有限公司，蛋白質含量實測值為 81.2%）；Alcalase 2.4 L和Flavourzyme（丹麥諾維信公司）；1 mol/L的氫氧化鈉標準溶液（自配）；中性甲醛溶液（自配）。AL204電子天平（上海梅特勒-托利多公司）；HWS12型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；FE20精密pH計（上海梅特勒-托利多公司）；磁力攪拌器；離心機。

1.2 試驗方法

1.2.1 Alcalase 2.4 L水解牛乳酪蛋白水解度的測定 水解度的測定采用pH-stat滴定法[3-4]。

1.2.2 Alcalase 2.4 L水解牛乳酪蛋白優化設計影響酪蛋白水解度的因素主要有：A底物濃度，B水解介質的pH值，C溫度和D加酶量。筆者用磷酸鹽緩沖液作為溶媒，考察底物濃度、pH值、溫度及加酶量對枯草桿菌堿性蛋白酶水解牛乳酪蛋白的影響，以水解度作為評價指標。該試驗采用正交表L9（34）安排試驗，試驗因素和水平的選擇如表1所示。

表1 Alcalase水解牛乳酪蛋白正交試驗因素水平表

1.2.3 Flavourzyme酶解牛乳酪蛋白Alcalase 2.4 L水解液的優化設計 本研究選A：pH值，B：酶量（μL），C 溫度（℃），D 時間（h），用中性甲醛滴定法[3]以滴定中消耗堿的量作為評價Flavourzyme酶解牛乳酪蛋白的程度，選用L16（44）正交表安排試驗，試驗設計如表2。

表2 Flavourzyme酶解正交試驗因素水平表

1.2.4 苦味評分標準[5-6]稱取奎啉0.1 g溶于50 mL 5%乙醇溶液中，從中取5 mL溶液用蒸餾水稀釋到100 mL，得到1.0×10-4g/mL等濃度的奎啉溶液，再進一步稀釋成 5.0×10-5、2.5×10-5、1.0×10-5、5.0×10-6g/mL等濃度的奎啉溶液，其苦味值分別定為 10.0、5.0、2.5、1.0、0.5，將制得的多肽溶液與不同濃度奎啉溶液比較，從而確定多肽的苦味值。

2 結果與分析

2.1 Alcalase 2.4 L酶解牛乳酪蛋白

研究按照Alcalase 2.4 L水解牛乳酪蛋白優化設計的方案，選用L9（34）正交表進行試驗，結果見表3。

表3 Alcalase酶解牛乳酪蛋白正交試驗結果

如表3所示，通過直觀分析法對試驗結果作了分析。經過對極差分析和比較（B>A>C>D）可以看出：各因素對Alcalase酶水解酪蛋白水解度的影響主次順序依次為B、A、C、D，表明溶媒的pH值對酪蛋白的水解度影響最大，其次依次是底物濃度、溫度、加酶量。根據表3中K1、K2、K3值的大小確定各因素的最優水平組合為A1B3C3D2，即試驗的最佳水解條件為：底物濃度2%、pH值8.5、溫度為55℃、加酶量為 20 μL。

2.2 Flavourzyme酶解牛乳酪蛋白Alcalase 2.4 L水解液

本研究選 A：pH 值，B：酶量（mL），C溫度（℃），D時間（h），用中性甲醛滴定法以滴定中消耗堿的量作為評價Flavourzyme酶解牛乳酪蛋白的程度，選用L16（44）正交表安排試驗，試驗結果見表4。

如表4所示，通過直觀分析法對試驗結果作了分析。經過對極差分析和比較（B＞D＞C＞A）可以看出：各因素對Flavourzyme酶解牛乳酪蛋白的影響主 次 順 序 依 次 為 B、D、C、A， 即 加 酶 量 對Flavourzyme酶解影響最大，其次依次是時間、溫度、pH 值。根據表4 中 K1、K2、K3、K4值的大小確定各因素的最優水平組合為A3B3C1D3，即試驗的最佳酶解條件為：pH值6.5、加酶量為120 μL、溫度為55℃、時間 3 h。

表4 Flavourzyme酶解正交試驗結果

2.3 苦味值評價結果

首先評價單一使用Alcalase 2.4 L的苦味值，苦味值較明顯，根據評定，苦味值為5。隨后隨著風味蛋白酶的加入水解完成后水解液的苦味有了大幅度的降低，根據評定水解液的苦味值降至2.5。風味蛋白酶是一種內切酶和外切酶的混合酶，能夠有效地將疏水性氨基酸從多肽端切除，降低多肽的苦味。

3 結 論

在酪蛋白水解過程中，pH值可能影響中間絡合物的解離狀態，不利于催化生成產物。由于Alcalase 2.4 L酶水解酪蛋白過程中溶液是由堿性至酸性變化的，所以保持pH值恒定對于酶水解反應至關重要。

加入風味蛋白酶后水解液的pH值無明顯變化，用pH-stat法計算得到水解液的水解度幾乎不變。后來改用測定氨基氮含量的方法反映水解度的變化，結果表明了隨著水解時間的延長，水解液中氨基氮含量明顯呈上升趨勢。同時，蛋白質水解液的苦味值得到大幅度降低。離心后得到的蛋白質水解液具有水解度高，透明澄清，低苦味的特點。為下一步功能肽的分離制備奠定了基礎。

[1] 李小暉.牛乳中酪蛋白的結構特性及其應用[J].食品工業，2002，（1）：29-31.

[2] 孔 芳，衣杰榮，丁 勇.枯草桿菌蛋白酶水解牛乳酪蛋白的條件研究[J].湖南農業科學，2009，（6）：9-11.

[3] Adler Nissen.Enzymic Hydrolysis of Food Proteins[M].London:Elsevier Applied Science Publishers,1986.116-124.

[4] 袁 斌，呂桂善，劉小玲.蛋白質水解度的簡易測定方法[J].廣西農業生物科學，2002，（2）：113-115.

[5] 趙新淮.大豆水解物水解度測定的研究[J].東北農業大學學報，1995，26（2）：178-181.

[6] 吳建中，趙謀明，寧正祥，等.雙酶法生產低苦味大豆多肽研究[J].食品工業科技，2003，（4）：24-26.