茶籽餅降解菌的篩選及降解條件優(yōu)化與發(fā)酵效果的研究

田璨熙，吳永堯，婁立起，周志成

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

我國是世界油茶栽培面積最大，品種最豐富、茶油產(chǎn)量最高的國家。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全國每年產(chǎn)茶籽約6 000萬t，榨油后的茶籽餅在3 500萬t以上[1-2]。過去多用作燃料或肥料，對茶籽餅的綜合利用率較低[3]。據(jù)報(bào)道,茶油下腳料中茶籽餅粗蛋白含量為12%～16%[4]，粗蛋白中，不僅必需氨基酸含量較其它餅粕高[5]，而且賴氨酸的含量較高[6-7]。說明茶籽餅具有極高的飼料開發(fā)價(jià)值，對于改良土壤板結(jié)、提高土壤肥力等方面也具有很高的潛在利用價(jià)值?？梢姡裟芾每茖W(xué)的方法將對其所含有的粗蛋白成分進(jìn)行降解利用，茶籽餅的開發(fā)利用將變廢為寶，前景誘人。

由于茶籽餅中含有天然的抑菌成分，抗菌作用較強(qiáng)[8]，以致于一般的微生物不能以茶籽餅為底物生長[9]，利用微生物對其進(jìn)行降解比較困難，目前國內(nèi)用微生物對茶籽餅進(jìn)行有效降解的報(bào)道較少，因此筆者針對目前國內(nèi)缺乏對茶籽餅進(jìn)行微生物降解研究的現(xiàn)狀，對能降解茶籽餅中粗蛋白的菌種進(jìn)行廣泛篩選，并對菌株發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為茶籽餅綜合開發(fā)利用提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株從自然環(huán)境中分離篩選；茶籽餅為某茶油廠提供。

富集培養(yǎng)基（g/L）：茶籽餅 30，121℃下滅菌20 min；酪素平板培養(yǎng)基（g/L）：干酪素 10，溶解，加水定容至1 000 mL并調(diào)pH值為5；瓊脂2.5%。復(fù)篩培養(yǎng)基（g/L）：（a）種子培養(yǎng)基為牛肉膏 5，蛋白胨10，NaCl 5 ，自然 pH 值；（b）搖瓶培養(yǎng)基：茶籽餅40。斜面培養(yǎng)基為另加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%瓊脂的種子培養(yǎng)基。

1.2 方 法

1.2.1 篩選方法 將采集的土壤和水樣等樣品按質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的接種量分別接種到富集培養(yǎng)基37℃條件下振蕩培養(yǎng)3 d。利用蛋白酶對酪素的水解作用進(jìn)行平板法篩選，將初篩后的活性單菌落菌置于4℃冰箱種斜面保存，用于進(jìn)一步復(fù)篩。

將初篩的菌株接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，接種于含6%的茶籽餅的復(fù)篩搖瓶培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)3 d，進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.2 分析方法 分析方法分為如下幾個(gè)部分。（a）降解菌篩選方法。初篩用水解圈法對將接種于富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后菌落進(jìn)行多次平板劃線純化并保留；將初篩菌置于搖瓶中發(fā)酵通過酶活及生物量測定進(jìn)行復(fù)篩。（b）粗酶液制備。供試菌株搖瓶發(fā)酵液經(jīng)紗布過濾后，8 000 r/min離心20 min，收集上清液。（c）游離氨基酸含量測定。用茚三酮法[10]。（d）蛋白酶活力的測定.福林酚法測定[11]。酶活力定義為1 mL液體酶在40℃和pH 9的條件下1 min水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個(gè)酶活力單位，以U/mL表示。（e）生物量的測定。平板菌落計(jì)數(shù)法及比濁法[12]。（f）降解率的測定。用凱式定氮法[13]將發(fā)酵前后底物經(jīng)三氯乙酸浸泡處理12 h后過濾，棄上清液，對發(fā)酵前的粗蛋白含量與發(fā)酵后的粗蛋白含量分別進(jìn)行測定：

降解率=[（發(fā)酵前粗蛋白含量-發(fā)酵后粗蛋白含量）/發(fā)酵前粗蛋白含量]×100%

1.2.3 培養(yǎng)基及條件的優(yōu)化 保持基礎(chǔ)培養(yǎng)基其它條件不變，依次改變培養(yǎng)基的茶籽餅質(zhì)量分?jǐn)?shù)、碳源和無機(jī)鹽種類，等量接種T7菌懸液4 mL，37℃，裝液量為100 mL/250mL，150 r/min搖床養(yǎng)48 h，通過對發(fā)酵液中蛋白酶活性及生物量測定來進(jìn)行單因子優(yōu)化。

在確定最佳茶籽餅質(zhì)量分?jǐn)?shù)，碳源和無機(jī)鹽后，以初始pH值，接種量，溫度，麥芽糖含量為對象，通過極差分析來確定最佳的培養(yǎng)條件，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

1.2.4 發(fā)酵周期的測定 將菌株接種于上述最佳培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下?lián)u瓶發(fā)酵，在培養(yǎng)24 h后每隔12 h取樣測定其蛋白酶活力，生物量作圖分析。1.2.5 降解菌的評價(jià) 將經(jīng)篩選后的出發(fā)菌株及大豆粕高效降解菌M1，DB2[14]分別接種于底物為9%的茶籽餅（T7最適合的底物）和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%的豆粕（M1，DB2最適合的底物）中搖瓶振蕩培養(yǎng)48 h，以發(fā)酵后的生物量，酶活力為依據(jù)比較降解效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)蛋白酶的茶籽餅降解菌的篩選

2.1.1 初 篩 將若干個(gè)樣品經(jīng)茶籽餅培養(yǎng)基富集培養(yǎng)后，得到數(shù)株能以茶籽餅為底物生長且產(chǎn)生胞外分泌蛋白酶菌株，分別編號為T1到TN，其中T1、T6、T7、T9、T20、T31的蛋白水解能力較高。

2.1.2 復(fù) 篩 為進(jìn)一步驗(yàn)證供試菌的降解能力，將初篩菌種中產(chǎn)生蛋白水解圈較大的6株菌發(fā)酵培養(yǎng)后，菌株T7表現(xiàn)出的酶活力和生物量為最優(yōu)，因此選擇T7為出發(fā)菌，如表2所示。

表2 菌株對茶籽餅的降解效果

2.2 單因素優(yōu)化

2.2.1 茶籽餅的質(zhì)量分?jǐn)?shù) 菌株T7在不同茶籽餅質(zhì)量分?jǐn)?shù)下表現(xiàn)出的酶活力及生物量差異如表3所示。菌株T7在茶籽餅質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%時(shí)所表現(xiàn)出的生物量與蛋白酶活力最高，說明茶籽餅中所含的抑菌物質(zhì)對菌株T7抑制作用很小，在茶籽餅質(zhì)量分?jǐn)?shù)9%以下，隨茶籽餅質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，基質(zhì)中所含的某個(gè)或某些物質(zhì)可能促進(jìn)該菌種生長及蛋白酶的合成及分泌，而造成酶活和生物量區(qū)間性的線性增加，為此選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%的茶籽餅作為底物。

表3 不同的基質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)對生物量及酶活力的影響

2.2.2 碳 源 在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入了麥芽糖能明顯提高蛋白酶活力及生物量。結(jié)果一方面表明C/N比的升高能提高酶活及生物量，另一方面可能是因?yàn)榧尤臌溠刻菫殡p糖，在發(fā)酵工藝上一般是屬于菌體非直接利用的碳源，即對于該菌體而言，麥芽糖可能既是作為一種適合其自身的慢速利用碳源，對其蛋白酶分泌產(chǎn)生了延長作用，其水解產(chǎn)物葡萄糖又可能作為了一種誘導(dǎo)因子，對其蛋白酶的合成在分子水平上產(chǎn)生了誘導(dǎo)作用，結(jié)果如表4所示。

表4 不同碳源對生物量及酶活力的影響

2.2.3 無機(jī)鹽離子 由表5可知：Ca2+作為通過增加膜的通透性而促進(jìn)酶的分泌的作用在本實(shí)驗(yàn)條件下對此菌并沒有顯著作用，可能是由于茶籽餅本身所含有的茶皂素為天然的表面活性劑，對增加膜的通透性的效果更優(yōu)于Ca2+；加入KH2PO4，NaCl后，發(fā)酵液的酶活和生物量都有提高，但酶活升高不顯著，其原因可能由于離子濃度增加促進(jìn)菌株生長代謝，消耗過量的底物，反而對蛋白酶的合成產(chǎn)生了一定程度的抑制作用；茶籽餅本身含有一定量的無機(jī)離子，外加的無機(jī)離子對菌體酶活的影響不明顯，如表5所示。

2.3 正交條件優(yōu)化結(jié)果

表5 不同無機(jī)離子對生物量及酶活力影響

根據(jù)各單因子優(yōu)化的結(jié)果，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%的茶籽餅為底物，麥芽糖作為碳源，結(jié)合初始pH值，接種量，培養(yǎng)溫度，做出的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明最佳培養(yǎng)條件組合是：100 mL培養(yǎng)基中，初始PH值為5，接種量為3 mL，麥芽糖2%，溫度42℃，如表6所示。

表6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4 最佳培養(yǎng)時(shí)間

選擇上述的最佳培養(yǎng)條件，對發(fā)酵時(shí)間作梯度處理可知，蛋白酶在60 h后合成量顯著增高，但因基質(zhì)濃度和代謝物累積等因素的影響，生物量明顯降低，代謝途徑傾向于次級代謝產(chǎn)物的合成，菌株T7在84 h時(shí)，酶活達(dá)到最高，因此選擇84 h為最佳發(fā)酵周期。通過凱式定氮法得出，此時(shí)粗蛋白降解率為48.7%，其結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同時(shí)間對發(fā)酵的影響

2.5 降解菌的評價(jià)

將供試菌與M1，DB2于豆粕和茶籽餅中作對比發(fā)酵后，菌株T7在以兩種基質(zhì)作為底物時(shí)的生物量差異較小，T7受茶籽餅中受含抑菌物質(zhì)的影響小，酶活力在茶籽餅為降解底物時(shí)活性較高，說明茶籽餅對T7的產(chǎn)酶有促進(jìn)作用，而菌株M1，DB2明顯受到抑菌成分的影響，對茶籽餅無明顯降解效果。表明菌株T7對茶籽餅的降解作用顯著。三者之間的蛋白酶活力和生物量差異如表7、表8所示。

表7 三種菌株對豆粕的降解效果比較

表8 三種菌株對茶籽餅降解效果比較

3 結(jié)果與討論

本研究中，對茶籽餅降解菌進(jìn)行篩選，得到了一株受茶籽餅中抑菌物質(zhì)影響小的產(chǎn)蛋白酶菌株，并對其發(fā)酵條件優(yōu)化后，表現(xiàn)出良好的降解效果。

菌株T7，在培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)化時(shí)，表現(xiàn)出的不同于一般細(xì)菌生長曲線的規(guī)律，可能是因?yàn)樵摼暧煞N子培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基之后，由于茶籽餅中的大部分營養(yǎng)物質(zhì)不能直接被細(xì)菌吸收利用，而需要經(jīng)一段時(shí)間的降解，導(dǎo)致菌株因基質(zhì)原因表現(xiàn)出了生長周期的延長或二次生長，進(jìn)而導(dǎo)致培養(yǎng)周期的延長；另外，在對菌株T7分別對大豆粕和茶籽餅的降解能力比較表明，菌株對茶籽餅表現(xiàn)出了良好的適應(yīng)性，以茶籽餅為底物的條件下，基質(zhì)對菌體生長及產(chǎn)酶表現(xiàn)出了明顯的促進(jìn)性作用，可能在含有大量表面活性劑的基質(zhì)中，表面活性劑對T7的生長代謝起到了促進(jìn)作用。

由于茶籽餅中抑菌物質(zhì)對大部分細(xì)菌的生長的抑制作用，導(dǎo)致了利用發(fā)酵法降解茶籽餅的困難，但利用菌株T7降解茶籽餅，可提高茶籽餅的綜合利用率和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，從而減少茶油下腳料的廢棄對環(huán)境造成的污染及提高資源的利用率。但此菌株酶活力比一些高活性蛋白酶菌種要低，為此可以進(jìn)一步嘗試對該菌種進(jìn)行誘變等方法，提高其酶活性，增加產(chǎn)物得率。此外，菌株T7能隨基質(zhì)濃度的升高而表現(xiàn)出更高的蛋白酶活力和茶籽餅對其它菌種則出現(xiàn)抑制作用的機(jī)理，也值得進(jìn)一步研究。

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