印度洋深海沉積物中酵母菌IR08的分離與鑒定

趙昌會 ，孫 佳 ，黃翔玲

（1.湖南科技學院，湖南 永州 425100；2.國家海洋局第三海洋研究所，福建 廈門 361005；3.國家海洋局海洋生物遺傳資源重點實驗室，福建 廈門 361005）

海洋中酵母菌的含量比較低，一般情況下，遠海的水體中酵母菌的濃度低于10 cells/dm3，而污染的沉積物中為100 cells/g以上，底質中酵母菌的含量受沉積物類型的影響比較大[1]。可通過濃縮水樣或加富培養來分離酵母菌，但對于含量較少、生長較慢的酵母菌株，則需要運用特殊的富集法分離[2]。實驗室環境與自然環境的差異，加上采樣的困難，限制了人們對深海酵母菌的研究。Nagahama等[3－6]從1 000～11 000 m的深海樣品中分離到多種酵母菌，其中一些菌株與已知菌株同源性差異較大，具有研發的新潛力。本文對分離自印度洋中脊底質的深海酵母IR08進行了研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 菌株IR08由黃翔玲同志采用PDA培養基從印度洋 IR-T3C1站（31.0877°S、59.1124°E）水深4 051 m 的洋底0～3 cm層底質樣品中分離獲得。

1.1.2 培養基 PDA培養基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂1.5%、pH 7.0（深海海水配制）；同化碳源基礎培養基：MgSO4·7H2O 0.05%、酵母膏 0.02%、（NH4）2SO40.5%、KH2PO40.1%（3.4%（W/V）NaCl溶液配制）。

1.2 方法

1.2.1 深海酵母的顯微鏡觀察 挑取少量的新鮮酵母菌混勻于載玻片的無菌水中，蓋上蓋玻片，油鏡下觀察。

1.2.2 深海酵母菌的溫度和鹽度試驗 用接種環挑取少量的酵母接于鹽度分別為0、24、34、100的液體培養基中，分別在 4、10、25、35℃下培養（以不加菌液為對照），每隔24 h觀察培養液混濁度的變化。

1.2.3 深海酵母菌的碳代謝試驗 用接種環挑取少量酵母菌稀釋于碳源利用鑒定液體基礎培養基中，混勻，取0.4 cm3加到TH04酵母樣真菌鑒定板上（杭州微生物試劑有限公司），35℃搖床培養5 d（100 r/min）。

1.2.4 深海酵母菌DNA的提取與擴增 以酵母染色體DNA的提取為參考[7]。

1.2.5 深海酵母菌IR8的鑒定 菌株的染色體DNA 采用特異引物[8]ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCG TAACAAGG-3′和 LR6：5′-CGCCAGTTCTGCTTA-3′，擴增26S rDNA的D1/D2區及ITS區在內的一段核糖體DNA。其PCR擴增反應系統中包括：DNA模板 50 ng、正向及反向引物（各 10-5mol）、Taq DNA聚合酶（4 U）、2.5 mmol/μdm3的 dNTP 5 μL、5 μL 的10×PCR 緩沖液、DDW 補至 50 μL，26S rRNA 基因擴增程序：95℃預熱 4 min，94℃變性 1 min、52℃退火1 min、72℃延伸2 min，36個循環，最后 72℃ 10 min。對擴增的26S rDNA片段直接測序，測序引物選用F63、LR3；返回結果通過DNAMAN軟件處理，以此為對比目標，通過FASTA網上分析搜索EMBL數據庫，尋找同源性最高菌株，采用鄰接法[7]構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 IR08的菌落和菌體形態

IR08菌落淡紅色，圓形突起，較濕潤，直徑1～2 mm，易挑取。細胞卵圓形，單端芽殖（如圖1）。

圖1 IR08的細胞形態（100×）

2.2 不同溫度和鹽度對IR08生長的影響

IR08菌株受鹽度的影響較小，在25～35℃生長良好，10℃以下生長緩慢（如表1）。

表1 酵母IR08在不同時間、鹽度和溫度下的生長狀況

2.3 IR08的碳源利用特征

IR08除了能利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖及半乳糖外，還能利用尿素、纖維二糖、阿拉伯糖、棉子糖、肌醇和、松二糖、山梨醇等，但不能利用木醇、海藻糖、肌醇、木糖。

2.4 IR08菌株的鑒定

將26S rDNA的D1/D2區的序列測序，輸入到EMBL數據庫對比，得到rDNA分子同源性相似度最高為 Pichia guilliermondii-AY188372（98.8%），構建的系統發育樹如圖2。

圖2 IR08的系統發育樹

3 討論

酵母的鑒定主要借助于生理學特征，但其碳和氮的同化實驗常表現易變或區別不明顯，如紅酵母屬、擲孢酵母屬、木森頓酵母屬、鎖擲孢酵母屬等，需用ITS和5.8S DNA基因序列測定、18S rDNA及26S rDNA的轉錄間隔區的基因序列[1]，這為發現新種提供了良好的途徑。如Nagahama在深海底質中發現新種[6]。

季也蒙畢赤酵母能在含鉻量較高的條件下生長，并將其吸收[9]、也可富集重金屬銅[10]及防治果實產后的腐爛[11]；分離自海洋的季也蒙畢赤酵母具有高產菊粉酶[12]等活性，深海分離的酵母菌IR08在環境修復及果實防腐等方面的價值有待于研究開發。致謝：

本研究在國家海洋局第三海洋研究所葉德贊研究員的實驗室完成，對他在本研究中的指導和支持，謹致謝忱！

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