氮素對不同氮效率小黑麥基因型葉片保護酶活性和膜脂過氧化的影響

匡藝，李廷軒，余海英

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，四川 雅安625014；2.四川威遠縣環(huán)境監(jiān)測站，四川 威遠642450）

葉片是植物進行光合作用的主要器官，作物全株光合產(chǎn)物的90%～95%來自光合作用，光合時間的長短主要取決于葉片衰老的進程。自20世紀(jì)70年代，自由基傷害假說引入作物衰老研究以來活性氧自由基與作物衰老關(guān)系的研究成為學(xué)者關(guān)注的焦點［1］。研究表明，當(dāng)作物受到外界環(huán)境脅迫時，其清除活性氧自由基系統(tǒng)中的超氧化物歧化酶（superxoide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）會迅速啟動，來共同抵抗外界脅迫帶來的危害［2］。而活性氧毒害引發(fā)細胞膜脂過氧化產(chǎn)生的丙二醛（malondialdehyde，MDA），其含量的高低亦可反應(yīng)細胞膜脂過氧化程度和植物對逆境脅迫反應(yīng)的強弱［3］。氮是作物所需最多的營養(yǎng)元素，其在作物的保護酶代謝中起著重要作用。作物抗性生理的有關(guān)研究表明，細胞中SOD、POD、CAT活性和MDA含量變化因供氮量、作物品種、生育期不同而有很大的差異。據(jù)劉連濤等［4］報道，氮素缺乏會引起棉花（Gossypiumhirsutum）丙二醛含量升高，加速葉片的衰老。魏海燕等［1］對不同氮利用效率水稻（Oryzasativa）的研究表明，齊穗后的不同時期，氮高效水稻基因型的SOD、POD和CAT活性均顯著高于氮低效基因型，而MDA的含量顯著低于氮低效基因型。飼草作為畜牧業(yè)生產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)，其產(chǎn)量的高低對作物－家畜綜合系統(tǒng)的生產(chǎn)力產(chǎn)生重要影響。當(dāng)前，施用氮肥是增加飼草［5，6］與種子［7］產(chǎn)量、提高經(jīng)濟效益［8］、促進養(yǎng)分吸收［9］、改善品質(zhì)［10］的主要手段。然而隨著施氮量的增加，產(chǎn)投比下降，這在降低氮肥利用效率，帶來資源浪費的同時，也導(dǎo)致了水體富營養(yǎng)化等一系列環(huán)境問題。已有的研究表明，作物在吸收利用氮素方面普遍存在著基因型差異［13－15］，這使得挖掘作物自身吸收利用氮素的潛力，成為提高農(nóng)田氮肥利用率、減少氮素損失的有效途徑［16］。小黑麥（Triticosecale）作為禾本科牧草中的優(yōu)良種，在我國飼草中占有重要的地位［17］。目前針對小黑麥的研究多集中于品質(zhì)［18］、高產(chǎn)評價［19］、水鹽脅迫［20，21］等方面，對于氮素供應(yīng)對不同氮效率小黑麥基因型葉片保護酶活性和膜脂過氧化隨生育期變化的研究鮮見報道。因此，本研究擬通過研究供氮水平對不同氮效率小黑麥基因型在苗期、分蘗期、拔節(jié)期和最佳刈割時期－抽穗期［22］時葉片保護酶活性和膜脂過氧化的影響，以及它們與地上部生物量的相關(guān)性，以期揭示不同氮效率小黑麥基因型對氮肥利用差異的可能原因及機理。

1 材料與方法

1.1 供試材料

依據(jù)2008－2009年的研究分類與評價，選取2個具有不同氮利用效率特征的小黑麥基因型為材料，分別為氮低效利用基因型（CIxt74），氮高效利用基因型（PI429186）。盆栽用土為青衣江河流沖積物發(fā)育而來的潮土，采自四川省雅安市雨城區(qū)大興鎮(zhèn)。其基本理化性質(zhì)為：有機質(zhì)9.07g／kg、全氮0.36g／kg、堿解氮25.74mg／kg、速效磷9.45mg／kg、速效鉀36.32mg／kg，pH 6.12。所用尿素含N 46.70%，磷酸二氫鉀含P2O552.17%、含K2O 34.53%，硫酸鉀含K2O 53.94%；其中尿素為市場購買，磷酸二氫鉀和硫酸鉀為分析純試劑。

1.2 試驗處理

于2009－2010年在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)科研園有防雨設(shè)施的網(wǎng)室進行盆栽試驗，試驗所用盆體上口徑27 cm，下口徑20cm，高23cm，每盆裝土15kg。據(jù)報道［23］，150.00kg N／hm2為小黑麥的最佳施氮量，故氮素處理設(shè)0g N／盆（N0）、0.25g N／盆（N1）、0.50g N／盆（N2）、1.00g N／盆（N3）4個水平，分別相當(dāng)于0，37.50，75.00和150.00kg N／hm2。所有處理的磷、鉀肥用量一致，按P2O50.60g／盆、K2O 0.50g／盆施入。試驗共8個處理，每個處理重復(fù)20次，完全隨機排列。其中60%氮肥和所有磷鉀肥配制成溶液在播種前5d與土壤充分混勻，其余40%氮肥作為追肥在拔節(jié)期施用。播種前選取飽滿的種子，用50%多菌靈消毒后堆悶6h。2009年11月25日播種，每盆播10粒種子，及時補種，于2009年12月29日，定苗為8株。全生育期進行病蟲害防治并適時灌溉，采用自然光照。

1.3 測定內(nèi)容與方法

在小黑麥的苗期（出苗后47d）、分蘗期（出苗后82d）、拔節(jié)期（出苗后102d）和抽穗期（出苗后140d）進行采樣，每次采樣每個處理取4次重復(fù)。采樣時將盆栽土壤和植株傾盆倒出，以免破壞植株完整根系。采收后，先用自來水洗凈葉片表面灰塵和污物，然后用蒸餾水潤洗，再用吸水紙將葉片附著的水分吸干。取同一盆中4株小黑麥用于葉片和根系生理測定，其余4株用于植物含氮量和根系形態(tài)的測定。將用于測定葉片生理的樣品剪碎、混勻，液氮速凍后存于－80℃超低溫冰箱中用于保護酶活性與膜脂過氧化產(chǎn)物的分析。用氮藍四唑（NBT）法測定SOD活性［24］；愈創(chuàng)木酚法測定POD活性［25］；過氧化氫法測定CAT活性［26］；硫代巴比妥酸（TBA）法測定 MDA含量［24］。將樣品根系和地上部剪斷分開，于烘箱中105℃殺青30min，將溫度調(diào)至75℃烘干至恒重，然后測定其干重。土壤基本理化性質(zhì)采用常規(guī)分析方法［27］。

1.4 統(tǒng)計分析

采用Excel 2003、唐啟義和馮明光［28］的DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮素對不同氮效率小黑麥基因型生物量的影響

各生育期小黑麥地上部生物量存在顯著的基因型差異（表1）。氮高效小黑麥基因型在同一生育期的同一供氮條件下，其地上部生物量顯著高于氮低效基因型。就各生育期而言，氮高效基因型在苗期各供氮條件下，其地上部生物量為氮低效基因型的1.12，1.93，1.64和1.67倍；分蘗期為氮低效基因型的1.18，1.02，1.27和1.30倍；拔節(jié)期時為氮低效基因型的1.26，1.22，1.16和1.37倍；到最佳刈割時期－抽穗期為氮低效基因型的1.15，1.09，1.16和1.21倍。針對同一小黑麥基因型，除苗期供試小黑麥基因型地上部生物量隨供氮量的增加其增產(chǎn)效果不明顯外，其余各生育期地上部生物量隨供氮量的增加而增大。在分蘗期、拔節(jié)期、抽穗期時，氮高效小黑麥基因型在正常供氮條件下，其地上部生物量分別比不施氮條件增產(chǎn)84.49%，40.49%和40.43%；對氮低效基因型而言，其地上部生物量分別比不施氮條件下增產(chǎn)66.87%，29.64%和33.15%。這表明，在正常供氮條件，氮高效基因型隨供氮量增加的增產(chǎn)效果大于氮低效基因型。

表1 氮素對不同氮效率小黑麥基因型地上部生物量的影響Table 1 Effects of nitrogen on biomass of shoot in triticale genotypes with different N use efficiency g／株 Plant

2.2 氮素對不同氮效率小黑麥基因型葉片保護酶活性的影響

2.2.1 氮素對不同氮效率小黑麥基因型葉片SOD活性的影響 SOD是植物體內(nèi)清除活性氧自由基的關(guān)鍵酶，能催化生物體內(nèi)分子氧活化的第一中間產(chǎn)物——超氧自由基（O2·－）發(fā)生歧化反應(yīng)，生成O2和H2O2，其活性大小是植株衰老和抗性的良好指標(biāo)。各生育期小黑麥SOD活性存在顯著的基因型差異（表2），氮高效小黑麥基因型在同一生育期的同一供氮條件下，SOD活性顯著高于氮低效基因型。就各生育期而言，氮高效基因型在各供氮條件下，其苗期SOD活性為氮低效基因型的1.08，1.03，1.18和1.31倍；分蘗期為氮低效基因型的1.13，1.07，1.34和1.17倍；拔節(jié)期為氮低效基因型的1.20，1.25，1.19和1.10倍；到最佳刈割時期——抽穗期為氮低效基因型的1.11，1.12，1.29和1.19倍。針對同一生育期同一小黑麥基因型，其SOD活性隨供氮量的增加而增強，且其活性在N2和N3條件下達到較強值。正常供氮條件下，小黑麥氮高效基因型在苗期、分蘗期、拔節(jié)期和抽穗期時其SOD活性分別比不施氮條件下提高了26.43%，6.27%，23.04%和21.14%；而氮低效基因型，其SOD活性分別比不施氮條件下提高了4.34%，2.38%，34.41%和13.29%。這表明，在正常供氮條件下，氮高效基因型的SOD活性增強的能力強于氮低效基因型。2.2.2 氮素對不同氮效率小黑麥基因型葉片POD活性的影響 POD是細胞防御活性氧毒害酶系統(tǒng)的成員之一，能催化H2O2氧化其他底物以清除H2O2。各生育期小黑麥POD活性存在顯著的基因型差異（表3），并呈先下降后上升的趨勢。除苗期和分蘗期，氮高效小黑麥基因型在同一生育期的同一供氮條件下，POD活性基本表現(xiàn)出顯著高于氮低效基因型。就各生育期而言，氮高效基因型在各供氮條件下，在苗期時SOD活性為氮低效基因型的1.02，0.78，0.76和0.72倍；分蘗期為氮低效基因型的0.91，1.26，0.96和0.83倍；拔節(jié)期時為氮低效基因型的0.95，1.04，1.23和0.99倍；到最佳刈割時期——抽穗期為氮低效基因型的1.11，1.06，1.25和1.10倍。針對同一生育期同一小黑麥基因型，其SOD活性隨供氮量的提高，規(guī)律性不明顯。正常供氮條件下，分蘗期和抽穗期時，小黑麥氮高效基因型SOD活性分別比不施氮條件下提高了4.94%和7.07%，在苗期和拔節(jié)期時下降了12.41%和0.15%；而對氮低效基因型而言，其SOD活性在苗期、分蘗期和抽穗期時分別比不施氮條件下提高了24.07%，16.20%和8.31%，在拔節(jié)期時下降了4.04%。這表明在不同生育期，供氮對POD活性的影響不一致。

表2 氮素對不同氮效率小黑麥基因型葉片SOD活性的影響Table 2 Effects of nitrogen on SOD activity of leaf in triticale genotypes with different N use efficiency U／g FW

表3 氮素對不同氮效率小黑麥基因型葉片POD活性的影響Table 3 Effects of nitrogen on POD activity of leaf in triticale genotypes with different N use efficiency △OD470／（g FW·min）

2.2.3 氮素對不同氮效率小黑麥基因型葉片CAT活性的影響 CAT能夠催化H2O2分解為H2O與O2，使得H2O2不至于與O2在鐵螯合作用下反應(yīng)生成非常有害的·OH，是植物體內(nèi)主要的保護酶之一。各生育期小黑麥CAT活性存在顯著的基因型差異（表4），氮高效小黑麥基因型在同一生育期的同一供氮條件下，CAT活性基本表現(xiàn)出顯著高于氮低效基因型。就各生育期而言，氮高效基因型在各供氮條件下，在苗期時SOD活性為氮低效基因型的1.71，2.09，1.60和2.10倍；分蘗期為氮低效基因型的1.46，2.25，2.11和1.71倍；拔節(jié)期時為氮低效基因型的1.04，1.85，1.38和1.48倍；到最佳刈割時期——抽穗期為氮低效基因型的1.44，1.54，1.45和2.08倍。針對同一小黑麥基因型，CAT活性在苗期隨供氮量的增加先下降后上降，而在分蘗期和抽穗期時其活性隨供氮量的增加而加強，在拔節(jié)期時，則為先上升后下降。正常供氮條件下，小黑麥氮高效基因型在分蘗期、拔節(jié)期和抽穗期時其CAT活性分別比不施氮條件下提高了126.07%，80.48%和247.37%，在苗期時下降了17.76%；而氮低效基因型，其CAT活性分別比不施氮條件下提高了92.67%，26.70%和96.78%，苗期時下降了33.81%。這表明雖然在苗期，氮高效基因型的CAT活性在正常供氮條件下，其活性較不供氮下降，但是其降幅較氮低效基因型低，而在分蘗期、拔節(jié)期和抽穗期時，其活性較低效基因型提高明顯。

2.3 氮素對不同氮效率小黑麥基因型葉片MDA含量的影響

MDA是植物在逆境和衰老過程中膜脂過氧化作用的產(chǎn)物，其含量常用來衡量膜脂過氧化的程度。小黑麥MDA隨著生育期，其含量逐漸增加。同一生育期同一供氮條件下，氮高效小黑麥基因型葉片中MDA含量低于或顯著低于氮低效基因型（表5）。就各生育期而言，氮高效基因型在各供氮條件下，在苗期時，MDA含量較氮低效基因型降低了1.03%，9.52%，35.20%和33.86%；分蘗期除N2供氮條件下，氮高效基因型MDA含量高于氮低效基因型外，其余各供氮條件較氮低效基因型分別降低了17.50%，8.75%和72.41%；拔節(jié)期時較氮低效基因型降低了18.49%，23.75%，19.48%和15.89%；到最佳刈割時期——抽穗期較氮低效基因型降低了33.35%，14.99%，24.22%和23.57%。針對同一生育期同一小黑麥基因型，其MDA含量隨供氮水平的升高而降低。正常供氮條件下，小黑麥氮高效基因型在苗期、分蘗期、拔節(jié)期和抽穗期時其MDA含量分別比不施氮條件下降了63.54%，79.41%，43.96%和39.54%；而氮低效基因型，其 MDA 含量分別比不施氮條件下降了45.44%，38.42%，45.70%和30.98%。這表明，在氮高效基因型膜脂過氧化程度較氮低效基因型低，在逆境脅迫下細胞受傷害較小。

表4 氮素對不同氮效率小黑麥基因型葉片CAT活性的影響Table 4 Effects of nitrogen on CAT activity of leaf in triticale genotypes with different N use efficiency U／（g FW·min）

表5 氮素對不同氮效率小黑麥基因型葉片MDA含量的影響Table 5 Effects of nitrogen on MDA content of leaf in triticale genotypes with different N use efficiency μmol／mg FW

2.4 小黑麥葉片保護酶活性、膜脂過氧化與生物量的相互關(guān)系

小黑麥保護酶活性及膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量不僅存在顯著的基因型差異，同時與小黑麥地上部生物量有著密切的相互關(guān)系。小黑麥地上部生物量與葉片中SOD、POD、CAT活性存在的相關(guān)性因生育期不同，而有不同的體現(xiàn)（表6）。在苗期，POD活性與地上部生物量呈極顯著的負相關(guān)關(guān)系；分蘗期時，CAT活性與地上部生物量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，到了拔節(jié)期時其葉片中SOD和CAT活性與地上部生物量達顯著和極顯著正相關(guān)關(guān)系，而到抽穗期時，CAT活性與地上部生物量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。除苗期外，MDA含量與地上部生物量呈顯著或極顯著負相關(guān)關(guān)系。由此表明，小黑麥保護性酶系統(tǒng)中的SOD、POD和CAT是一個清除活性氧自由基的體系，清除活性氧自由基是其共同作用的結(jié)果，其清除能力也因生育時期不同各異。由于氮高效基因型SOD、POD、CAT在各生育期具有較高的活性，更能及時清除活性氧自由基，有效的阻止高濃度氧的積累和膜脂過氧化，降低葉片受損傷程度，提高其光合性能。因此，使其生產(chǎn)出更多的光合產(chǎn)物，增進物質(zhì)積累，從而利于其提高氮素利用效率。

3 討論

在植物體內(nèi)存在SOD、POD、CAT等一系列保護酶，它們能夠在逆境脅迫中維持活性氧的代謝平衡并保護細胞膜結(jié)構(gòu)，協(xié)同抵御不良環(huán)境的脅迫，保證植物正常生長。MDA作為細胞膜脂過氧化產(chǎn)物之一，其含量的多少反應(yīng)細胞受損的程度。因而，通常情況下將抗氧化酶活性和MDA含量視為作物在忍受逆境脅迫的生理指標(biāo)［29］。已有的研究表明［2］，作物葉片中抗氧化酶系統(tǒng)存在品種差異，且其活性高低受到生育期的影響。本試驗條件下，不同氮利用效率小黑麥基因型的保護酶活性存在顯著的基因型差異。除苗期POD活性外，氮高效小黑麥基因型葉片中SOD、POD、CAT活性在各生育期的同一供氮條件下顯著高于氮低效基因型。同時，其活性隨供氮量增加的幅度大于氮低效基因型。與保護酶活性相反，氮高效小黑麥基因型葉片膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量在同一生育期同一供氮條件下顯著低于氮低效基因型。針對同一生育時期而言，氮高效小黑麥基因型隨供氮量的增加，其細胞受損害的程度較氮低效基因型明顯降低。由此說明，與氮低效基因型相比，氮高效小黑麥基因型葉片中活性氧清除酶系統(tǒng)能及時清除活性氧自由基，有效的阻止高濃度氧的積累和膜脂過氧化作用，從而降低葉片的損傷程度，這與相關(guān)學(xué)者對水稻的研究結(jié)果一致［1］。正常情況下，細胞自由基活性氧的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，這些產(chǎn)物的濃度很低不會引起傷害［2］。但是當(dāng)出現(xiàn)脅迫狀況時，這一動態(tài)平衡就受到破壞，此時，作物就會啟動相應(yīng)的抗氧化系統(tǒng)來阻止細胞膜脂過氧化，減弱其受損程度。本研究表明，SOD、POD、CAT活性均能對地上部生物量產(chǎn)生影響，但其作用大小受生育時期的影響。表現(xiàn)為，SOD活性大小在拔節(jié)期時，與地上部生物量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系；POD活性大小在苗期時與地上部生物量呈極顯著負相關(guān)關(guān)系，CAT則在分蘗期、拔節(jié)期和抽穗期時與地上部生物量呈顯著或極顯著正相關(guān)關(guān)系。由于苗期時，氮高效基因型地上部生物量在各供氮條件下大于氮低效基因型，說明氮高效小黑麥基因型在苗期時，其抵抗外界脅迫的能力較強，葉片受損程度相對較小，所以其POD活性可能就沒有達到較強值，用于保護其可能受到的損傷。而對于氮低效小黑麥基因型，由于其對氮素吸收和利用的能力較弱，故在苗期時，就表現(xiàn)出細胞受到損害的情況，故其清除活性氧自由基的POD酶啟動，表現(xiàn)出其活性顯著高于氮高效基因型。因此，這時表現(xiàn)出POD活性在苗期時與地上部生物量呈顯著負相關(guān)關(guān)系。隨著小黑麥的生長，表現(xiàn)出SOD、POD、CAT協(xié)同作用，共同清除活性氧自由基，從而降低MDA含量，達到保護葉片生理功能，提高產(chǎn)量的作用。

表6 小黑麥葉片保護酶活性、膜脂過氧化與生物量的相互關(guān)系Table 6 Relationships between biomass of shoot and protective enzyme activities，lipid peroxidation of leaf in Triticale genotypes

4 結(jié)論

氮高效小黑麥基因型（PI429186）在各生育期的同一供氮條件下，其地上部生物量顯著高于氮低效小黑麥基因型（CIxt74）。在同一生育期，小黑麥地上部生物量隨供氮水平的增加而增大，氮高效基因型在正常供氮條件下，其生物量在分蘗期、拔節(jié)期和抽穗期分別較不施氮條件下增加了84.49%，40.49%和40.43%；而氮低效基因型增加了66.87%，29.64%和33.15%，其增產(chǎn)效果小于氮高效基因型。除苗期POD活性在各條件下氮高效小黑麥基因型低于氮低效小黑麥基因型，氮高效基因型小黑麥的SOD、POD、CAT活性在各生育期的同一供氮條件下，其保護酶活性高于氮低效小黑麥基因型，而MDA含量顯著低于氮低效小黑麥基因型。相關(guān)分析表明，小黑麥地上部生物量與SOD、POD、CAT活性的相關(guān)性因生育期不同其相關(guān)性不一。SOD活性在拔節(jié)期時與地上部生物量呈極顯著正相關(guān)，POD活性在苗期時與地上部生物量呈極顯著負相關(guān)，CAT則在分蘗期、拔節(jié)期和抽穗期時與地上部生物量呈顯著或極顯著正相關(guān)；而與MDA含量在分蘗期、拔節(jié)期和抽穗期時呈顯著或極顯著負相關(guān)。

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