兩種策略分別克隆紫花苜蓿光敏色素A、B基因

李平，楊玲玲，陳其新，史瑩華，嚴學兵，陳占寬，王成章＊

（1.河南農業大學牧醫工程學院，河南 鄭州450002；2.河南省農作物新品種重點實驗室，河南 鄭州450001）

紫花苜蓿（Medicagosativa）是世界公認的一種多年生優質豆科牧草，被譽為“牧草之王”［1］，其在我國草產業中的重要性日益凸現［2］，苜蓿產業也正逐步發展成為我國農業領域的新興產業［3］。苜蓿的秋眠性（fall dormancy，FD）是苜蓿在秋季日照長度變短和氣溫下降時的一種適應性生長特性［4，5］。研究表明，苜蓿的秋眠性與抗寒性［6，7］、生產性能［8－12］等相關，因此，很多國家都將其作為苜蓿栽培選擇品種時的首要指標［7］，也成為苜蓿研究中的熱點和重要參考性狀［13，14］。盡管對苜蓿秋眠性的機理尚存爭議，但目前被廣泛接受的觀點為苜蓿秋眠是一種光周期反應（photoperiod response）［4，5，7］，不同秋眠型苜蓿品種對光周期反應的差異與它們原產地生長季節的自然日照長度有很大關系，是植物對環境條件長期適應的結果。因此，從光周期角度研究光受體與苜蓿秋眠性的關系可能是揭示苜蓿秋眠性機理的有效途徑之一。

植物接收光周期信號主要是通過光受體（photoreceptor）來實現的。通過光受體，光才能與植物內源的發育程序相互作用，調節相關基因的表達［15］。目前，已知至少存在4類感受不同波長的光受體：光敏色素（phytochrome，PHY），主要感受紅光（620～700nm）和遠紅光（700～800nm）；隱花色素（cryptochrome，CRY）和向光素（phototropin，PHOT，也稱作NPH1），感受藍光（380～500nm）和近紫外光 （UV－A，320～380nm）；一個或幾個尚未鑒定的紫外光B（UV－B）受體，感受紫外光B區域（280～320nm）的光［16］。光敏色素是植物體內最重要也是目前研究最為深入的一類光受體［17］，它們的發現被認為是植物光形態建成研究的里程碑［18］。光敏色素是一個較為復雜的基因家族，擬南芥（Arabidopsisthaliana）PHY家族至少包括5個執行不同生理功能的成員（PHYA，PHYB，PHYC，PHYD，PHYE），其中尤以PHYA、PHYB研究最為深入［19］。

采用酶聯免疫測定法（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）研究了3個不同秋眠型苜蓿品種在8，12和16h光照條件下葉片和頂芽中的PHYB含量。結果表明，3個品種均是在8h光照下PHYB合成量高，而且秋眠型比非秋眠型苜蓿葉片中PHYB含量高。由此推測，PHYB作為綠色植物主要光受體，可能通過光周期（短日照）參與苜蓿秋眠的調控［20，21］。另外，PHYA也是一種重要的光敏色素，已有研究證實PHYA與PHYB共同參與了植物的多種生理反應［22－24］，因此，推測PHYA也可能參與苜蓿秋眠的調控。

利用模式物種已知基因信息資源克隆近緣物種未知基因是一種常用而且高效的方法。紫花苜蓿雖是非常重要的豆科牧草，但其已經測定的基因資源卻非常有限。幸運的是，與紫花苜蓿同屬的蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula）是一種即將完成全基因組序列測定的豆科模式植物，具有大量的基因信息資源（www.medicago.org），兩者具有非常近的親緣關系［比其他豆科模式物種如豌豆（Pisumsativum）、百脈根（Lotuscorniculatus）、大豆（Glycinemax）親緣關系更近］，兩者二倍體的染色體數相同且基因具有高度的共線性，基因組具有非常高的同源性［25－28］，例如幾丁質酶基因在氨基酸水平同源性達到98%［29］。因此，對于欲研究的未知紫花苜蓿基因，可以通過預測或查找蒺藜苜蓿相關基因，然后將其近似假定為未知的紫花苜蓿基因和最重要參考序列，再以之作為模板設計引物進行PCR反應，從而直接克隆得到紫花苜蓿基因序列。這種策略將“未知基因”變成“已知基因（近似基因）”，引物為特異引物而非簡并引物，僅需普通PCR反應即可得到基因部分或全長序列，因而將是克隆紫花苜蓿未知基因的一條捷徑。

目前，紫花苜蓿的PHYA和PHYB基因都尚未被克隆。本研究采用2種不同的策略對紫花苜蓿PHYA和PHYB基因進行了克隆。其中，PHYA采用較為常用的方法，以mRNA為起點，運用反轉錄－聚合酶鏈式反應（reverse transcription－polymerase chain reaction，RT－PCR）和cDNA 末端快速擴增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）獲得PHYAcDNA主體序列，輔以染色體步移法獲得PHYA5′端序列；PHYB則根據比較基因組學和生物信息學的有關原理，首先預測蒺藜苜蓿PHYB基因，然后以預測的蒺藜苜蓿PHYB基因序列設計引物直接擴增得到紫花苜蓿PHYB基因主體序列，再使用染色體步移法得到該基因的5′端序列。本研究最終獲得PHYA的cDNA基因全長和PHYB基因的近全長序列，為進一步利用分子生物學手段探究這2種光敏色素基因在苜蓿秋眠性調控機制中的作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 2007年7月，將紫花苜蓿品種 WL－525HQ盆栽于實驗室，根據試驗需要隨時摘取其莖端葉片提取總RNA和基因組DNA。

1.1.2 主要試劑 快捷型植物基因組DNA提取系統（目錄號：DP321）、DNA凝膠回收試劑盒（目錄號：DP209）、質粒抽提純化試劑盒等購自天根生化科技（北京）有限公司；總RNA提取試劑（RNAiso Plus，目錄號：D9108A）、反轉錄試劑盒（目錄號：DRR023）、3′－Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒、5′－Full RACE Kit試劑盒、染色體步移試劑盒（genome walking kit，目錄號：D316）、LA Taq（目錄號：DRR02）、pMD19－T載體（目錄號：D102）、感受態細胞JM109（目錄號：D9052）、DNA Marker等購自寶生物工程（大連）有限公司；PCR引物合成和測序主要由北京三博遠志技術服務有限責任公司和寶生物工程（大連）有限公司完成。

1.1.3 引物設計 參考GenBank中發表的有關基因序列，使用Oligo（Version 6.54）軟件設計引物。

1.2 RNA和DNA的提取

1.2.1 植物總RNA的提取 將約25mg新鮮的紫花苜蓿莖頂端葉片迅速轉移至用液氮預冷的研缽中研磨至粉狀，按照RNA提取試劑盒（Takara，RNAiso Plus）的操作說明提取總RNA。

1.2.2 植物基因組DNA的提取 取紫花苜蓿莖頂端新鮮葉片約100mg在液氮中研磨至粉狀，之后按試劑盒（天根快捷型植物基因組DNA提取系統）說明書進行操作。

1.3 紫花苜蓿PHYA基因的克隆

1.3.1 紫花苜蓿PHYAmRNA基因片段的克隆 因為目前尚無有關紫花苜蓿PHYA基因序列的報道，因而，本研究根據GenBank已發表的與苜蓿親緣關系較近的其他豆科植物（主要參考大豆和豌豆）的PHYA基因序列的保守區域設計1對PCR引物，序列為，F1：TTGGGGTTTGGTAGTTTGCCAT；R1：AGCCTTGAATGATGATCTTG GATGC。反轉錄用Random 9mers作引物，反應條件：65℃1min，30℃5min，25min勻速升溫至65℃，然后65℃20min，98℃5min，5℃5min。PCR擴增按照94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃45s，30個循環；72℃5min進行。對擴增產物先進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后用凝膠純化回收試劑盒回收預期的目的DNA片段，委托北京三博遠志技術服務有限責任公司進行測序。

1.3.2 紫花苜蓿PHYA3′RACE 采用3′－Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒。根據獲得的PHYA基因片段序列，設計3′RACE套式PCR特異性引物，Outer和Inner引物序列分別為：3OTGTGCGATATGCTGATGCGAGAT，3IAGATAAGAGAGATAGCTTTATGGATGTCCGAG。具體操作基本按照試劑盒說明書進行，其中，反轉錄體系為10μL，反應條件為42℃60min，70℃15min；套式PCR Outer反應條件為：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30個循環；72℃10min。之后取Outer PCR產物1μL作為模板進行Inner反應，條件為：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30個循環；72℃10min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，割膠回收目的片段，再進行連接、轉化、克隆和測序。

1.3.3 紫花苜蓿PHYA5′RACE 采用5′－Full RACE Kit試劑盒。根據獲得的PHYA基因片段序列，設計5′RACE套式PCR特異性引物，Outer和Inner引物序列分別為：5OACAGCTGCCATTCCACATACAGT，5I CGTCGAT CCTAATATCCATAACTTG。按照試劑盒說明書進行操作。主要步驟包括去磷酸化處理、“去帽子”反應、5′RACE Adaptor的連接、反轉錄反應、Outer PCR反應和Inner PCR反應。其中 Outer PCR反應條件為：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃150s，20個循環；72℃10min。Inner PCR反應條件為：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃150s，25個循環；72℃10min。擴增產物進行電泳分離、回收、連接、轉化、克隆和測序。

1.3.4 紫花苜蓿PHYA5′端染色體步移 將以上克隆得到的3個PHYA序列片段，通過拼接和分析比對后發現5′RACE并未得到5′端cDNA全長，而是缺失了約367bp的編碼（coding sequence，CDS）序列，重復1次試驗后仍未得到理想結果，于是改用染色體步移法獲得5′端缺失的CDS序列。引物設計模板為上述克隆拼接得到的cDNA序列，第1，2，3輪特異引物分別為 A53CACTATCTCCATCTTCATCGCTGTC、A52GGGA ATATCTGTGGCCGGATAGTG和A51CGGTAACACGGTGAATAATCGCAT。具體操作按照染色體步移試劑盒（genome walking kit）說明書進行，其中，以 WL－525HQ基因組DNA為模板，以試劑盒提供的 AP引物1，2，3，4作為上游引物分別與3輪特異引物進行PCR反應，延伸時間為2min。3輪反應后，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，將效果最好（條帶亮、單一）的AP引物1與A51引物組合的第3輪PCR產物分離、克隆和測序。

1.4 紫花苜蓿PHYB基因的克隆

通過預測與紫花苜蓿同屬的蒺藜苜蓿的PHYB基因，然后以其為參考序列，設計引物進行PCR反應，從而直接克隆得到紫花苜蓿PHYB基因序列。

1.4.1 蒺藜苜蓿PHYB基因預測 在通過與幾種近緣物種已測序PHYB基因的反復比對及在GenBank非冗余核苷酸數據庫中使用Blastn搜索后，發現在登錄號為AC152185的蒺藜苜蓿細菌人工染色體（bacterial artificial chromosome，BAC）克隆測序結果中，在第25 551～32 007位堿基，有1段長度為6 457bp的序列，注釋為“GAF；heavy metal sensor kinase”基因（尚無中文翻譯，可暫譯為“重金屬感受器激酶”），編碼蛋白登錄號為：ABN07956.1，全長1 152個氨基酸。經查，光敏色素基因中包含GAF區（GAF domain）。這段序列與豌豆、大豆和百脈根的PHYB基因高度相似且長度、結構都非常吻合，將此段序列通過Blastx比對后，推測該段序列極可能為蒺藜苜蓿的PHYB基因，而并非注釋的“GAF；heavy metal sensor kinase”基因（盡管光敏色素中包含GAF區，但并不能用GAF代表整個基因），經與其他物種PHYB基因序列比對分析后可知該序列方向與mRNA序列相反，應為mRNA序列的反向互補序列。為進一步驗證其可靠性，將該序列用FASTA－Protein程序（http：／／www.ebi.ac.uk／Tools／fasta33／）進行比對，得到與Blastp非常近似的結果，即：該段序列所編碼的氨基酸序列與以下幾種植物的PHYB相似性很高，由高到低依次為：豌豆（93%）、百脈根（88%）、大豆（87%）和葡萄（Vitis vinifera）（80%）（后略），由注釋信息可知，該基因由4個外顯子和3個內含子組成。為進一步驗證該基因注釋的外顯子與內含子邊界的正確性，采取了3種驗證方式：1）通過GENSCAN（http：／／genes.mit.edu／GENSCAN.html）在線服務分析，Organism選擇“擬南芥”（玉米預測效果較差），對比發現前3個外顯子與“GAF；heavy metal sensor kinase”注釋相一致，而最后1個外顯子不符。2）對后段GENSCAN預測不準區域通過氨基酸序列tBlastn查找最后1個外顯子在核苷酸序列中相應的位置。3）應用GT－AG規則對整個基因的外顯子－內含子邊界進行驗證。通過驗證，認為在GenBank中登錄號為AC152185、名為“GAF；heavy metal sensor kinase”的基因，實際上應為PHYB基因，而其關于基因長度及內含子、外顯子邊界等相關注釋是可信的，于是得到預測的蒺藜苜蓿PHYB基因的CDS（3 459bp）和包含了內含子的基因組序列（6 457bp）。

1.4.2 紫花苜蓿PHYB基因主體序列的克隆 直接以預測的蒺藜苜蓿PHYB基因CDS序列為模板，設計了2對能部分重疊的PCR引物（因基因較長，采用分段克隆再拼接的策略），分別為：LU1CCTGAACAACAGATCACT GCTTAC、17UCAAGCACCTCTTCTCCCACC 和 HU1TTCAGTTAGCCGCACAGTCGTT 與 HL2 CTTCTCC GCGTCACAGGTAGTTC。基因組DNA提取見1.2.2（下同）。LU1與17U組合的PCR反應條件為：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃90s，35個循環；72℃5min。HU1與 HL2組合的PCR反應條件為：94℃1min；98℃10s，68℃6min，30個循環；72℃10min。目的產物分別進行克隆和測序。

1.4.3 紫花苜蓿PHYB5′端染色體步移 通過對上述1.4.2中獲得的序列進行拼接，得到了紫花苜蓿PHYB的主體序列，3′端與預測的蒺藜苜蓿PHYB相差僅19bp，而5′端相差約300bp，為給下游試驗提供盡量長的序列信息和獲得可能的PHYB啟動子序列，使用染色體步移法對PHYB5′端序列進行克隆。引物設計模板為上述1.4.2中克隆拼接得到的CDS序列，第1，2，3輪特異引物分別為B52TGACAACCATGAGGAGCACGAAGCG、B53AACCTCGACGCCTGCGGTATATCAGT和B54CCCATATACGGCTCCAAATCAATC。其余操作同1.3.4，將效果最好的AP4引物第3輪PCR產物克隆和測序。

2 結果與分析

2.1 獲得紫花苜蓿PHYA基因cDNA全長序列

使用引物F1和R1進行RT－PCR擴增得到與預期擴增長度相符的約570bp的cDNA片段（圖1）。測序后獲得了長度為549bp的cDNA片段，Blast比對結果證實這個cDNA片段與其他已克隆的PHYA基因具有很高的相似性，說明是PHYA基因片段的序列。根據此片段設計特異引物3O和3I、5O和5I，用RACE技術擴增到此基因的5′和3′末端序列（圖2和3）。將這3個片段的序列進行拼接，得到長度為3 130bp（GenBank登錄號為GQ379905）的PHYA基因序列。而后，使用染色體步移法克隆得到了1 260bp的5′端序列（圖4）（Gen－Bank登錄號為GQ379904），補齊了此前缺失的5′端序列。再經過分析比對和拼接剪切，得到了紫花苜蓿PHYACDS全長，共3 375bp，編碼1 125個氨基酸。經分析，紫花苜蓿PHYA基因與已知的GenBank中的植物PHYA基因的相似性都比較高（大多在75%以上），與豌豆、百脈根、山黧豆（Lathyrussativus）等豆科植物都達到92%以上。

圖1 PHYART－PCR擴增產物Fig.1 PHYART－PCR amplification

圖2 PHYA3′RACE－PCR擴增產物Fig.2 PHYA3′RACE－PCR amplification

2.2 獲得紫花苜蓿PHYB基因組DNA近全長序列

圖3 PHYA5′RACE－PCR擴增產物Fig.3 PHYA5′RACE－PCR amplification

圖4 PHYAgenome walking擴增產物Fig.4 PHYAgenome walking amplification

圖5 PHYBPCR擴增產物Fig.5 PHYBPCR amplification

使用2對引物LU1、17U和HU1、HL2進行PCR擴增，分別得到與預期擴增片段相符的2個片段（圖5和6）。測序結果表明，兩片段長度分別為1 097和4 997bp。染色體步移獲得了1 752bp的5′端序列（圖7）。將3段序列拼接后得到長度為7 150bp的基因序列（登錄號 GQ379902），其中包含了5′端非翻譯區（UTR）、3個內含子和長度為3 425bp的CDS序列（編碼1 141個氨基酸），達到預測的蒺藜苜蓿PHYB基因編碼序列的99.0%。將紫花苜蓿PHYBCDS序列與編碼氨基酸序列分別進行Blastn和Blastp，得到的相似性由高到低分別為：蒺藜苜蓿預測PHYB（97%）、豌豆PHYB（91%）、大豆PHYB（86%）和百脈根PHYB（85%）；蒺藜苜蓿預測PHYB（97%）、豌豆PHYB（93%）、百脈根PHYB（89%）和大豆PHYB（88%）。

圖7 PHYBgenome walking擴增產物Fig.7 PHYBgenome walking amplification

分析發現，紫花苜蓿PHYB與預測的蒺藜苜蓿PHYB，不僅基因結構及其保守區序列十分相似，并且在非編碼區的基因序列相似性也很高。紫花苜蓿PHYB5′端上游長度為886bp的序列與預測的蒺藜苜蓿PHYB5′端上游序列相似性達到78%，一致性（Identities）＝630／804，兩者內含子序列相似性也接近90%。非編碼區具有這樣高的序列相似性，說明可以嘗試在蒺藜苜蓿已知或預測基因的CDS外端設計引物，這樣會使引物設計的范圍拓寬，就可能直接克隆出未知紫花苜蓿基因的全長，從而省去RACE和染色體步移等操作，大大提高試驗效率，節約試驗成本。

3 討論

本研究采用了2種基因克隆策略分別克隆紫花苜蓿PHYA和PHYB基因，現對兩者進行比較：1）PHYA和PHYB分別以mRNA和基因組DNA為試驗起點，前者由于mRNA容易降解，因此對操作和試驗條件要求較高，而且進行PCR前需要反轉錄；后者可獲得內含子等更多基因信息，但內含子較大時也會增大克隆難度和測序成本。2）對于PHYA，先根據近緣物種已知PHYA基因序列在保守區設計引物RT－PCR擴增出一段序列，然后用3′RACE和5′RACE向兩端延伸；對于PHYB，先預測蒺藜苜蓿PHYB，然后直接以之設計PCR引物克隆得到紫花苜蓿PHYB的大部分序列，最后再用染色體步移法補齊5′端序列。兩者所采用的RACE和染色體步移法，盡管原理不同［30，31］，試驗起點不同，但都是根據已知序列片段向兩側延伸從而克隆未知區域序列的常用方法［32－34］。其中PHYA5′RACE未得到理想的結果（獲得5′cDNA全長），原因可能是多方面的，包括操作步驟較多、試驗條件要求高、試劑較為昂貴等［35］；而染色體步移法操作較為簡單，試驗條件要求較低，試驗成功率高，試劑成本較低，所以可優先作為克隆基因未知區域序列的方法。3）2種策略的本質差別在于前者只是按照克隆未知基因的一般思路和模式，后者則是充分利用蒺藜苜蓿與紫花苜蓿基因組的高度相似性，將“未知”變成“已知”，將未知基因的克隆變成了“已知（或準已知）”基因的克隆，這樣，無論采用mRNA還是基因組DNA為試驗起點，都可以通過查找或預測蒺藜苜蓿對應基因，然后直接應用或作為最重要的參考序列來克隆紫花苜蓿目的基因，這樣往往會使克隆難度大大降低，從而快速高效的完成試驗；但后者對試驗人員的理論基礎、生物信息學操作和分析能力要求較高，前期需要進行細致的分析和基因預測等工作。所以，針對特定的試驗條件、目的和研究背景，2種策略各有優劣。綜上所述，當前紫花苜蓿基因信息資源短缺，卻擁有大量可以利用的蒺藜苜蓿基因信息資源，在這種情況下，應充分利用蒺藜苜蓿資源研究紫花苜蓿，這非常適用于紫花苜蓿未知基因的克隆，同理，也適用于紫花苜蓿研究的其他很多方面［36］，例如用于蒺藜苜蓿的基因芯片同樣可適用于紫花苜蓿［37］等，因此，在進行某些紫花苜蓿相關研究時，可以先對蒺藜苜蓿進行研究，而后再應用于紫花苜蓿，可能繞道蒺藜苜蓿后，反而加快了研究進程。

植物接受環境中光信號并調節自身生理反應的機制是非常復雜的，常常有多種光受體共同參與和調控［24，38，39］，例如隱花色素和光敏色素一起調節植物的去黃化反應、光周期反應和光形態建成反應［15，18，22］。因此，欲探究光與苜蓿秋眠性的關系，除了光敏色素中的PHYA、PHYB外，還應將其他可能存在的光敏色素以及隱花色素、向光素甚至紫外光受體等其他光受體列入研究范圍。

本試驗使用2種策略克隆了紫花苜蓿PHYA和PHYB基因，所得序列均可以滿足下游實時定量PCR（Realtime PCR）和RNA干擾（RNAi）試驗要求，為進一步研究兩基因的功能及其與苜蓿秋眠的關系奠定了基礎；同時證明利用豆科模式植物蒺藜苜蓿已知基因組信息資源克隆紫花苜蓿未知基因的方法是可行和高效的，從而為克隆紫花苜蓿其他未知基因及其他方面研究提供思路和參考。

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