水稻農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系中共培養(yǎng)方法的優(yōu)化

馬永光，于翠梅，楊 巍，徐振峰

（1.沈陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110034；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧沈陽(yáng) 110161；3.中國(guó)種子集團(tuán)，遼寧沈陽(yáng) 110034）

共培養(yǎng)從廣義上講是將2種生物在一起培養(yǎng)并使其發(fā)生相互作用。該文中的共培養(yǎng)是指用攜帶目的基因片段的微生物和植物的愈傷組織在一起進(jìn)行培養(yǎng)，從而使微生物中的目的基因轉(zhuǎn)移到植物愈傷組織中，達(dá)到轉(zhuǎn)基因的目的。

農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)常采用固體培養(yǎng)基，也可采用液體培養(yǎng)基，但應(yīng)用較少。采用固體培養(yǎng)基時(shí)，可將外植體直接放在上面培養(yǎng)，也可在培養(yǎng)基上鋪1～2層濾紙，然后再放外植體進(jìn)行共培養(yǎng)。放濾紙可控制外植體上農(nóng)桿菌的過(guò)度增殖。該試驗(yàn)通過(guò)對(duì)影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系共培養(yǎng)的方法進(jìn)行試驗(yàn)比較，對(duì)以往的共培養(yǎng)方法進(jìn)行了部分優(yōu)化，并進(jìn)行了比較。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為水稻品種日本晴。

1.2 供試菌種

農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)采用攜帶有潮霉素抗性載體pCambial300，根癌農(nóng)桿菌LBA4404。

1.3 外植體的獲得

取飽滿(mǎn)、色澤好的水稻種子，去殼，用無(wú)菌水簡(jiǎn)單沖洗2遍后，用70%乙醇?xì)⒕?.5 min，再用含有2.5%的次氯酸鈉殺菌15 min，其中每50 mL次氯酸鈉含有1滴吐溫20，最后再用無(wú)菌水清洗5遍。在N6D（加入2,4－D的N6培養(yǎng)基）誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)（圖1）。將誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d左右的愈傷組織有選擇地轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基上（圖2）。采用26℃暗培養(yǎng)，時(shí)間控制在7～10 d，可出現(xiàn)大量狀態(tài)良好的愈傷組織。以后每10 d繼代1次，挑選色澤淡黃、質(zhì)地細(xì)膩、柔軟的愈傷組織進(jìn)行共培養(yǎng)。也可在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d左右，直接選取質(zhì)量?jī)?yōu)良的愈傷組織進(jìn)行共培養(yǎng)。

圖1 日本晴2.5%次氯酸鈉處理后培養(yǎng)4 d

圖2 日本晴誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d

1.4 農(nóng)桿菌的培養(yǎng)

將含有目的基因載體的農(nóng)桿菌在含有50 mg/L Kanamycin的YM平板上劃線(xiàn)，在28℃下暗培養(yǎng)3 d，用一金屬匙收集農(nóng)桿菌菌體（一小撮即可），使之懸浮于AAM培養(yǎng)基中，調(diào)整菌體濃度至OD600近似等于0.1，加入AS，使其最終濃度為100 mol/L，即為共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化水稻用的農(nóng)桿菌懸浮液。

1.5 外植體與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)

通常情況下，共培養(yǎng)時(shí)都用共培養(yǎng)基培養(yǎng)。該試驗(yàn)在共培養(yǎng)時(shí)未采用共培養(yǎng)基，而是利用簡(jiǎn)單的被0.5 mL AAM培養(yǎng)基浸濕的無(wú)菌濾紙，將侵染過(guò)后的愈傷組織轉(zhuǎn)移其上進(jìn)行共培養(yǎng)。共培養(yǎng)時(shí)間要精確控制在2～3 d，時(shí)間短（共培養(yǎng)2 d以下），農(nóng)桿菌侵染效果不明顯，則有部分愈傷組織未被侵染；共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（3 d以上），愈傷組織易大量染菌，轉(zhuǎn)至篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，愈傷組織周?chē)鷷?huì)長(zhǎng)出大量農(nóng)桿菌，不利于篩選。

從繼代培養(yǎng)上挑選狀態(tài)較好的愈傷組織，一般是繼代培養(yǎng)5～7 d，顆粒分明，色澤淡黃，質(zhì)地細(xì)膩柔軟的愈傷組織，放入100 mL無(wú)菌三角瓶中，加入適量農(nóng)桿菌懸浮液（懸浮液的量要保證有足夠的菌液與材料相接觸），在室溫下放置20 min，并不時(shí)搖晃或放到搖床上慢搖。再倒掉菌液，將愈傷組織放在無(wú)菌濾紙上吸去多余的菌液。然后采取2種不同的共培養(yǎng)方法：①轉(zhuǎn)移到鋪有1層無(wú)菌濾紙的固體共培養(yǎng)基上(圖3a)，28℃暗培養(yǎng)，時(shí)間嚴(yán)格控制在2～3 d之間，時(shí)間過(guò)短浸染效果不明顯，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，愈傷組織染菌。②無(wú)菌濾紙用0.5 mL AAM培養(yǎng)液浸濕（圖3b），鋪在培養(yǎng)皿中，然后直接將侵染過(guò)后的愈傷組織在其上進(jìn)行共培養(yǎng)。

2 d后轉(zhuǎn)至篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)。篩選培養(yǎng)基采用含有50 mg/L的潮霉素和400 mg/L的羧芐青霉素的N6D培養(yǎng)基，對(duì)愈傷組織進(jìn)行2次篩選，觀察2個(gè)篩選時(shí)間段上的效果和產(chǎn)生抗性愈傷組織的比率。

2 結(jié)果與分析

從圖3a與圖3b比較來(lái)看，在共培養(yǎng)階段，2種共培養(yǎng)方法中愈傷組織并無(wú)明顯差別。

圖3 2種共培養(yǎng)方法的培養(yǎng)效果

篩選階段是通過(guò)藥品選擇抗性愈傷組織，愈傷組織成功轉(zhuǎn)化在這個(gè)階段就可以體現(xiàn)出來(lái)。這時(shí)，愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)會(huì)發(fā)生明顯變化，非抗性愈傷會(huì)死亡，抗性愈傷會(huì)重新生長(zhǎng)。2次篩選的愈傷組織的狀態(tài)如圖4所示。

圖4 2次篩選的愈傷組織

將共培養(yǎng)后的愈傷組織放在含有50 mg/L潮霉素和400 mg/L的羧芐青霉素的篩選培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)14 d，再轉(zhuǎn)到新配制的篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)進(jìn)行第2次篩選。大部分愈傷組織在篩選10 d左右褐化，然后在褐化組織的邊緣重新生長(zhǎng)出乳白色的抗性愈傷組織。

通過(guò)培養(yǎng)效果比較及篩選培養(yǎng)過(guò)程中抗性愈傷組織的比例（表1）可以看出，采用2種方法共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化愈傷組織，在篩選培養(yǎng)過(guò)程中都獲得了較高頻率的抗性愈傷組織。但是直接用濾紙的這種方法簡(jiǎn)單易行，便于操作，利于控制愈傷組織染菌，客觀上利于增加產(chǎn)生抗性愈傷組織的比例。

表1 2種共培養(yǎng)方法下日本晴產(chǎn)生抗性愈傷組織的比率

3 討論

共培養(yǎng)階段是農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵時(shí)期，農(nóng)桿菌對(duì)愈傷組織的侵染過(guò)程，也是農(nóng)桿菌攜帶的基因片斷向愈傷組織細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過(guò)程。共培養(yǎng)時(shí)間一般是2～3 d。通常在這個(gè)階段都將愈傷組織在農(nóng)桿菌懸浮液中慢搖培養(yǎng)20 min后，吸干菌液，然后放到鋪有一層無(wú)菌濾紙的共培養(yǎng)基上培養(yǎng)。共培養(yǎng)基的作用是給愈傷組織提供足夠的營(yíng)養(yǎng)。該試驗(yàn)中，直接將懸浮培養(yǎng)后的愈傷組織放在浸有0.5 mL AAM液體培養(yǎng)基的無(wú)菌濾紙上培養(yǎng)，取得了更好的效果。

在愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后，含有目的基因的T-DNA片段已轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的基因組中，實(shí)現(xiàn)了外源基因。此時(shí)，農(nóng)桿菌細(xì)胞和受體植物細(xì)胞同時(shí)增殖生長(zhǎng)，而農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)繁殖會(huì)嚴(yán)重影響受體植物細(xì)胞的生長(zhǎng)。而直接用吸過(guò)農(nóng)桿菌懸浮液的濾紙進(jìn)行共培養(yǎng)，其過(guò)程時(shí)間短，濾紙中AAM液體培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)就可維持愈傷組織的短期生長(zhǎng)，同時(shí)客觀上有效控制了農(nóng)桿菌繁殖數(shù)量，保護(hù)了植物細(xì)胞，不易出現(xiàn)愈傷組織過(guò)度染菌的現(xiàn)象，避免在篩選時(shí)加大抗生素用量所帶來(lái)的不良后果。

這種方法省去了配制固體培養(yǎng)基的大量繁瑣的工作，方法簡(jiǎn)單易于操作，減少了污染機(jī)會(huì)，能夠保障試驗(yàn)順利有效地進(jìn)行，同時(shí)節(jié)省配制培養(yǎng)基的藥品，節(jié)約試驗(yàn)成本。

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行水稻轉(zhuǎn)基因時(shí)，在共培養(yǎng)階段用浸有0.5 mL AAM培養(yǎng)液的無(wú)菌濾紙直接鋪在培養(yǎng)皿中，將侵染過(guò)后的愈傷組織在其上進(jìn)行共培養(yǎng)，既能保證農(nóng)桿菌侵染植物愈傷組織的質(zhì)量，又能減少試驗(yàn)污染，節(jié)約成本，簡(jiǎn)便實(shí)用。

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