利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板檢測(cè)牛凍精活精子百分率和活力的效果分析

陳 軍，韓 東，鄧 強(qiáng)

(新疆畜牧總站，烏魯木齊 830009)

利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板檢測(cè)牛凍精活精子百分率和活力的效果分析

陳 軍，韓 東，鄧 強(qiáng)

(新疆畜牧總站，烏魯木齊 830009)

使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)牛細(xì)管凍精的活精子百分率和活力進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明：在檢測(cè)活精子百分率時(shí)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板與臺(tái)盼蘭染色兩者差異不顯著（P＞0.05）；解凍后1 h、 2 h和3 h，用計(jì)數(shù)板方法連續(xù)檢測(cè)解凍后精子活力，檢測(cè)數(shù)據(jù)重復(fù)性較好。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板直接檢測(cè)凍精的活精子百分率和活力方便有效。

凍精 ；活精子百分率 ；活力；血細(xì)胞計(jì)數(shù)板

凍精品質(zhì)分析是判斷種公牛繁殖力和凍存效果的有效手段[1]。精子的活力、活精子百分率、頂體完整率和畸形率與受胎率的關(guān)系密切。Woelders等[2]分析了牛和豬凍精和鮮精受胎率后指出，活精子百分率和頂體形態(tài)指標(biāo)可作為判斷受胎率的指標(biāo)。Januskauskas等[3]研究發(fā)現(xiàn)，牛冷凍精液解凍后的鏡檢活率與穿卵精子數(shù)及56天不返情率呈極顯著的正相關(guān)。

分析凍精質(zhì)量時(shí)，由于受實(shí)驗(yàn)條件的限制，尤其在人工授精現(xiàn)場(chǎng)分析時(shí)，大部分都采用目測(cè)評(píng)估。該法簡單快捷易于操作，但經(jīng)驗(yàn)性較強(qiáng)，不易掌握，分析結(jié)果因人而異變化較大，對(duì)奶牛場(chǎng)生產(chǎn)安排和經(jīng)濟(jì)效益產(chǎn)生一定的影響。而血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法作為一種最為可靠和最為經(jīng)典的計(jì)數(shù)技術(shù)，重復(fù)性好、準(zhǔn)確率高、方法簡便，它不僅適用于血細(xì)胞計(jì)數(shù)，還可用于其他動(dòng)物細(xì)胞在顯微鏡下計(jì)數(shù)。本實(shí)驗(yàn)探討采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板觀察凍精的活力和活精子百分率，并就這種方法的檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)方法進(jìn)行了比較。

1 材料與方法

1.1 凍精

西安德瑞良種奶牛推廣中心制。

1.2 器材

血細(xì)胞計(jì)數(shù)板(簡稱血球板)：QIU JING制造(02270113號(hào))，倒置顯微鏡：Nikon TS100。

1.3 精液稀釋液

配制參見[4]。

1.4 精液解凍

將細(xì)管凍精置于37℃溫水中30 s內(nèi)解凍，立即用38.5℃的TAPL液稀釋3倍，置于38.5℃的CO2培養(yǎng)箱，供后續(xù)檢測(cè)分析。

1.5 精子密度測(cè)定

取干凈的計(jì)數(shù)板平放于實(shí)驗(yàn)桌上，用少量水浸濕平行小溝的外沿，然后放上干凈的蓋玻片。吸取少量待測(cè)精液用超純水稀釋10倍，用移液槍取10 μl稀釋后的精液樣，拭凈槍頭，將槍頭輕輕置于蓋玻片邊緣，讓精液懸心平穩(wěn)地緩慢流出，通過毛細(xì)管作用進(jìn)入計(jì)數(shù)室內(nèi)。準(zhǔn)備一大的培養(yǎng)皿,下墊一塊浸濕的濾紙，將計(jì)數(shù)板放入其中，蓋上蓋子，靜止5 min。小心取出計(jì)數(shù)板，放于顯微鏡載物臺(tái)上靜止2～3 min, 待精子不再浮動(dòng)后便可計(jì)數(shù)。先在低倍鏡下找到計(jì)數(shù)室的中央大方格，然后在高倍鏡(40×物鏡)下計(jì)數(shù)，求出每毫升精液中精子的密度。

1.6 精子活力測(cè)定

目測(cè)評(píng)估(簡稱估測(cè))：為便于在顯微鏡下計(jì)數(shù)，用移液槍取10 μl待測(cè)精液，滴在載玻片，加上蓋玻片，置于顯微鏡下放大250～400倍檢查，計(jì)數(shù)一個(gè)視野下直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子與非直線運(yùn)動(dòng)精子的比例，求出活力；血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)(簡稱血球板計(jì)數(shù))：吸取待測(cè)精子用TAPL液再次稀釋(稀釋倍數(shù)以便于觀察計(jì)數(shù)為易)，用移液槍取10 μl TAPL液稀釋后的精子樣，讓精液通過毛細(xì)管作用進(jìn)入計(jì)數(shù)室內(nèi)，統(tǒng)計(jì)出4個(gè)角及中央共5個(gè)中方格中的非直線運(yùn)動(dòng)的(包括死精子、擺動(dòng)、旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng))的精子數(shù)，求出每毫升精液中非直線運(yùn)動(dòng)的精子數(shù)。每份精液在解凍后0 h、1 h、2 h和3 h分別計(jì)數(shù)精子活力，且每個(gè)時(shí)間段分別用2種方法重復(fù)計(jì)數(shù)5次，求其均值。

1.7 精子存活率

臺(tái)盼蘭染色法：100 μl待測(cè)精子加10 μl 0.4 g/L臺(tái)盼蘭溶液，38.5℃、CO2培養(yǎng)箱孵育3～5 min后制板，自然干燥，顯微鏡下觀察200個(gè)精子?；罹硬恢?，死精子呈紅色或藍(lán)色。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法：操作同精子活力檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)出4個(gè)角及中央共5個(gè)中方格中的死精子數(shù)，求出每毫升精液中死精子數(shù)。每份精液解凍后立即檢測(cè)，分別用兩種方法重復(fù)計(jì)數(shù)5次，求其均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

配對(duì)比較總體均數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法計(jì)數(shù)精子存活率的比較

從表1可知，兩種分析方法之間差異不顯著(P＞0.05)。血球板變異系數(shù)(CV)與臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)法的變異系數(shù)相近，重復(fù)性也較好。

表1 兩種方法計(jì)數(shù)精子活率的比較

2.2 3個(gè)時(shí)間段精子活力的分析

由表2統(tǒng)計(jì)分析表明，3個(gè)時(shí)間段凍精活力的檢測(cè)數(shù)據(jù)隨著時(shí)間的延長變異系數(shù)逐漸增大，組內(nèi)重復(fù)性好。

表2 3個(gè)時(shí)間段精子活力的分析

3 討論

在1852年就有人開始設(shè)計(jì)對(duì)紅細(xì)胞的計(jì)數(shù)辦法，1855年發(fā)明了用于計(jì)數(shù)血細(xì)胞的計(jì)數(shù)板。目前仍然使用的改良Neubauer計(jì)數(shù)板就是應(yīng)用最為廣泛和持續(xù)時(shí)間最為長久的一種。雖然各種類型的血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀已在廣泛使用，但血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法仍然是最為可靠和最為經(jīng)典的計(jì)數(shù)技術(shù)。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板用于精子計(jì)數(shù)目的，主要是在制作凍精和體外受精時(shí)測(cè)定精子的密度，而不用于活精子百分率或精子活力的測(cè)定?？赡苁怯捎谟?jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)池深0.1 mm，活精子和死精子不處于同一焦平面上，往往造成計(jì)數(shù)結(jié)果誤差。本實(shí)驗(yàn)以TAPL液為稀釋液，用血細(xì)胞板計(jì)數(shù)法分析凍精品質(zhì)，取得了較好的檢測(cè)效果。從表1和表2可知，凍精活率檢測(cè)與臺(tái)盼蘭染色法無顯著差異，而且凍精活力檢測(cè)數(shù)據(jù)重復(fù)性好，說明用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法檢測(cè)精子活力和活精子百分率是可行的。

為了便于觀測(cè)和保持精子活力，本試驗(yàn)采用了較為復(fù)雜的TAPL液，而在實(shí)際的應(yīng)運(yùn)中用滅菌生理鹽水，即可保證檢測(cè)分析進(jìn)行。由表2數(shù)據(jù)說明，經(jīng)3個(gè)時(shí)間段對(duì)解凍后精子活力進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)，隨著存放時(shí)間的延長監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)變異系數(shù)逐漸增大?？赡苁请S時(shí)間的延長，精子活力下降，出現(xiàn)扎堆現(xiàn)象，造成計(jì)數(shù)結(jié)果不準(zhǔn)確。所以，解凍后盡快進(jìn)行精子常規(guī)檢測(cè)，以保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。而3個(gè)時(shí)間段血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法重復(fù)性好，準(zhǔn)確性高，方法簡便，不失為一種提高牛精液常規(guī)檢查質(zhì)量，客觀反映精液情況的好方法。

[1] 董偉.家畜繁殖學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1999, 144.

[2] Waelders H. Fundamentals and recent development in cryopreservation of bull and boar semen[J].Vet Q, 1997, 19: 135-138.

[3] Januskauskas A, Johannisson A, Rodriguez-Martine H. Assessment of sperm quality through fluorometry and sperm chromatin structure assay in relation to field fertility of frozen-thawed semen from sedish AI bulls[J]. Theriogenology,2001, 55:947-961.

[4] Nolan JP, Graham JK, Hammerstedt RH. Artificial induction of exocytosis in bull sperm. Arch Biochem Biophys 1992, 292:311-322.

S823.3

A

1005-2739（2011）06-0015-02

2011-09-26

陳軍(1978-)，男，碩士，畜牧師。

E-mail：junchen08@163.com