深黃被孢霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)油脂的工藝參數(shù)及發(fā)酵前后底物組成變化規(guī)律的研究

孫若蕓 余 冰 毛湘冰 毛 倩 陳 洪 陳代文

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)研究所，動(dòng)物抗病營養(yǎng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雅安 625014)

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

深黃被孢霉(Mortierella isabellina As 3.3410)購自中國科學(xué)院微生物研究所;葡萄糖、瓊脂粉、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、酵母膏、硫酸銨和檸檬酸鈉等化學(xué)試劑均為分析純;馬鈴薯、麩皮、玉米淀粉和復(fù)合蛋白質(zhì)飼料(粗纖維、粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量分別為3.2%、18.3%和4.9%)均為市購，其中粉料已過40目篩。

斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g(去皮，切成小塊煮沸 30 min，紗布過濾)、葡萄糖 20.0 g、瓊脂粉15.0 g、磷酸二氫鉀3.0 g、七水硫酸鎂1.5 g、蒸餾水1 000 mL，調(diào) pH 至6.0，112 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基:葡萄糖10.00 g、磷酸二氫鉀0.10 g、七水硫酸鎂0.03 g、酵母膏0.20 g、硫酸銨0.20 g、蒸餾水 100 mL，調(diào) pH 至 6.0，112 ℃ 滅菌20 min。

基礎(chǔ)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基:一定量的發(fā)酵底物、檸檬酸鈉0.20%、磷酸二氫鉀0.20%、七水硫酸鎂0.05%，加蒸餾水使含水量達(dá)到50%，自然pH，不滅菌。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子液的準(zhǔn)備

將斜面培養(yǎng)7 d的深黃被孢霉接種到種子培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)2 d，待用。

由表5可知，傳熱系數(shù)K的試驗(yàn)測(cè)量值與理論計(jì)算值相吻合，平均誤差為0.442%，設(shè)備精度為99.558%，符合國家標(biāo)準(zhǔn)[5-6].

1.2.2 發(fā)酵底物的篩選

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別以玉米淀粉和麩皮(1∶1)的混合物，玉米淀粉、復(fù)合蛋白質(zhì)飼料和麩皮(1∶1∶2)的混合物以及復(fù)合蛋白質(zhì)飼料和麩皮(1∶1)的混合物作為發(fā)酵底物配制基礎(chǔ)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，每500 mL裝料量為50 g，含水量50%，按20%的接種量接種培養(yǎng)2 d的種子液，調(diào)節(jié)初始pH為6.0，采用雙溫度培養(yǎng)，連續(xù)發(fā)酵7 d(前2天培養(yǎng)溫度為28℃，后5天培養(yǎng)溫度為26℃)，每24 h搖動(dòng)1次三角瓶。每個(gè)處理設(shè)5個(gè)重復(fù)，結(jié)果以平均值表示。

1.2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

在確定發(fā)酵底物為玉米淀粉和麩皮的混合物的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵條件，主要考察底物配比即玉米淀粉∶麩皮(A)、含水量(B)、接種量(C)和裝料量(D)這4個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，按照L9(34)正交表安排試驗(yàn)，詳見表1。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，結(jié)果以平均值表示。

表1 發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal test design for fermentation conditions

1.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

以玉米淀粉和麩皮(1∶3)的混合物作為發(fā)酵底物，每250 mL裝料量60 g，含水量60%，按30%的接種量接種發(fā)酵2 d的種子液，調(diào)節(jié)初始pH為6.0，采用雙溫度培養(yǎng)連續(xù)發(fā)酵7 d，每24 h搖動(dòng)1次三角瓶。該處理設(shè)5個(gè)重復(fù)，結(jié)果以平均值表示。

1.2.5 發(fā)酵前后底物理化性質(zhì)分析

分別測(cè)定驗(yàn)證試驗(yàn)中發(fā)酵前后底物的還原糖、蛋白質(zhì)濃度以及中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌木質(zhì)素(ADL)、總淀粉和直鏈淀粉含量，并對(duì)發(fā)酵前后底物做掃描電鏡(SEM)分析及X射線衍射(XRD)分析。

1.2.6 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

將發(fā)酵后的產(chǎn)物在65℃下烘干至恒重，過40目篩，－20℃保存待測(cè)。

油脂、纖維(NDF和ADL)含量及總能的測(cè)定參照張麗英［7］的方法;脂肪酸組成及含量的測(cè)定參照 Ruiz-Rodriguez等［8］的方法;還原糖、蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定參照楊金龍等［9］的方法;總淀粉含量的測(cè)定采用酶水解法［10］;直鏈淀粉含量的測(cè)定參照王平［11］的方法;SEM和XRD分析參照閔偉紅等［12］的方法。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

單因素試驗(yàn)結(jié)果采用SAS 12.0中ANOVA過程對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，在方差分析顯著的情況下，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較;正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel軟件計(jì)算，并進(jìn)行多指標(biāo)評(píng)分及有重復(fù)數(shù)的方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵底物的確定

經(jīng)測(cè)定，發(fā)酵前每100 g玉米淀粉和麩皮的混合物，玉米淀粉、復(fù)合蛋白質(zhì)飼料和麩皮的混合物以及復(fù)合蛋白質(zhì)飼料和麩皮的混合物的油脂含量分別為 2.06、2.93和 4.33 g(干物質(zhì)基礎(chǔ))。從圖1可以看出，采用玉米淀粉和麩皮的混合物，玉米淀粉、復(fù)合蛋白質(zhì)飼料和麩皮的混合物以及復(fù)合蛋白質(zhì)飼料和麩皮的混合物作為發(fā)酵底物，每100 g發(fā)酵產(chǎn)物最終獲得的油脂量分別為15.28、9.18和5.74 g(干物質(zhì)基礎(chǔ))，各處理間差異極顯著(P＜0.01)。經(jīng)過7 d連續(xù)發(fā)酵，以玉米淀粉和麩皮的混合物或玉米淀粉、復(fù)合蛋白質(zhì)飼料和麩皮的混合物作為底物進(jìn)行發(fā)酵，極大地提高了油脂產(chǎn)量，油脂含量分別是發(fā)酵前的7.4和3.1倍;以復(fù)合蛋白質(zhì)飼料和麩皮的混合物作為發(fā)酵底物，油脂產(chǎn)量提高較少，其油脂含量?jī)H比發(fā)酵前提高了32.6%。因此，本試驗(yàn)篩選出的適宜的發(fā)酵底物為玉米淀粉和麩皮的混合物。

2.2 發(fā)酵條件的確定

發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果見表2和表3。根據(jù)表2中極值R可知，影響油脂產(chǎn)量的因素由主到次依次為含水量、裝料量、底物配比(玉米淀粉∶麩皮)和接種量，由表3中Fj值可知，含水量和裝料量對(duì)油脂產(chǎn)量影響極顯著(P＜0.01)。根據(jù)表2中K值大小，篩選出最佳發(fā)酵條件為A2B3C3D3，即發(fā)酵底物中玉米淀粉∶麩皮為1∶3、含水量60%、接種量30%、每250 mL裝料量60 g。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

利用篩選出的最適發(fā)酵底物，在優(yōu)化后的發(fā)酵條件下生產(chǎn)出的發(fā)酵產(chǎn)物的油脂含量為102 g/kg DM，在置信度為99%的置信區(qū)間(77.1 ～102.9 g/kg DM)范圍內(nèi);總能從發(fā)酵前的15.81 MJ/kg DM 提高到了20.44 MJ/kg DM。如表4所示，發(fā)酵對(duì)油脂中的PUFAs有提高趨勢(shì)，如C18∶3(GLA)由 3.17% 提高到 4.03%，C22∶6［二十二碳六烯酸(DHA)］由0.18%提高到1.70%。

2.4 發(fā)酵前后底物理化性質(zhì)分析結(jié)果

2.4.1 化學(xué)分析結(jié)果

發(fā)酵前后底物的化學(xué)組成見表5。經(jīng)過發(fā)酵，底物中的NDF、ADL、總淀粉和直鏈淀粉含量有不同程度下降，其中直鏈淀粉含量甚至可忽略不計(jì)，然而，底物中還原糖和蛋白質(zhì)濃度有所升高。

圖1 不同發(fā)酵底物對(duì)深黃被孢霉產(chǎn)油脂量的影響Fig.1 Effects of different fermentation substrates on the lipid production by Mortierella isabellina

2.4.2 SEM 和XRD分析結(jié)果

圖2為不同放大倍數(shù)下發(fā)酵前后玉米淀粉的SEM圖，進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后玉米淀粉的顆粒被腐蝕，小顆粒淀粉增多，玉米淀粉顆粒由光滑近球形變?yōu)榇植诘牟灰?guī)則形。圖3為發(fā)酵前后玉米淀粉的XRD圖，經(jīng)對(duì)比可知，通過發(fā)酵，玉米淀粉的特征峰消失，變?yōu)榈湫偷摹梆z頭狀”峰形，即玉米淀粉晶型結(jié)構(gòu)消失。

3 討論

Peng等［6］接種紅樹林內(nèi)生真菌(Microsphaeropsis sp.)孢子懸液固態(tài)發(fā)酵小麥秸稈和小麥麩的混合物，28℃連續(xù)發(fā)酵11 d，發(fā)酵產(chǎn)物油脂含量為42 g/kg DM;在添加纖維素酶和優(yōu)化發(fā)酵條件后，油脂含量提高到80 g/kg DM。Conti等［5］也采用固態(tài)發(fā)酵，接種綺麗小克銀漢霉(Cunninghamella elegans CCF 1318)孢子懸液發(fā)酵谷物，通過添加花生油和優(yōu)化發(fā)酵條件，28℃發(fā)酵10 d后，發(fā)酵產(chǎn)物中油脂含量為91 g/kg DM。以上這些研究所采用的發(fā)酵時(shí)間均長于本研究，但其發(fā)酵產(chǎn)物中油脂含量要低于本研究最終獲得的油脂含量(102 g/kg DM)，出現(xiàn)這種結(jié)果可能存在以下幾點(diǎn)原因:一是菌種產(chǎn)油脂能力的不同。本試驗(yàn)選用的菌種是深黃被孢霉，產(chǎn)油脂的量通常能達(dá)到其細(xì)胞干重的40%～50%。二是發(fā)酵底物的不同。玉米淀粉較之小麥秸稈等是更為理想的碳源，玉米淀粉中的無氮浸出物(NFE)含量高達(dá)85%，已有研究報(bào)道高碳氮比培養(yǎng)基更有利于油脂的大量蓄積［13－14］。另外，黃忠建等［15］在液態(tài)培養(yǎng)基上進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，深黃被孢霉產(chǎn)油脂最適的碳源為葡萄糖，而玉米淀粉易被水解為葡萄糖。三是本研究采用雙溫度培養(yǎng)。Shinmen等［16］研究表明，低溫更利于油脂的蓄積。四是接種方式不同。本研究選用接種菌絲體，陳波等［17］的研究確定了接種菌絲體較接種孢子是更為合理的接種方式。

表2 不同發(fā)酵條件對(duì)深黃被孢霉產(chǎn)油脂量的影響Table 2 Effects of different fermentation conditions on the lipid production by Mortierella isabellina

通過篩選發(fā)酵底物和優(yōu)化發(fā)酵條件，提高了發(fā)酵產(chǎn)物中油脂的含量，并對(duì)油脂中PUFAs含量有提高趨勢(shì)，但要低于液態(tài)發(fā)酵相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果。如余龍江等［18］通過向深黃被孢霉培養(yǎng)基中添加0.8 g/L的谷氨酸，使花生四烯酸(ARA)的產(chǎn)量提高到了1.41 g/L;而使用不同的深黃被孢霉突變株進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，研究結(jié)果表明可顯著提高培養(yǎng)基中 GLA 的含量［17，19－20］。本試驗(yàn)中 PUFAs 含量低于前人研究結(jié)果的原因可能包括以下2點(diǎn):一是本試驗(yàn)采用的菌種是未經(jīng)物理化學(xué)等誘變的原始菌株，產(chǎn)油脂能力，特別是產(chǎn)PUFAs能力有限;二是采用的發(fā)酵方式為固態(tài)發(fā)酵，國內(nèi)外已有研究結(jié)果［6，21－22］和本研究的正交試驗(yàn)結(jié)果均表明含水量對(duì)油脂產(chǎn)量影響極顯著，含水量高更有利于油脂的蓄積。因此，固態(tài)發(fā)酵方式在影響油脂生成的同時(shí)，可能也影響了PUFAs的合成。

表3 深黃被孢霉產(chǎn)油脂量發(fā)酵條件的方差分析Table 3 Variance analysis of fermentation conditions for the lipid production by Mortierella isabellina

表4 發(fā)酵前后油脂中脂肪酸組成Table 4 Fatty acid composition of lipid before and after fermentation %

表5 發(fā)酵前后底物的化學(xué)組成Table 5 Chemical composition of substrate before and after fermentation

圖2 不同放大倍數(shù)下發(fā)酵前后玉米淀粉的SEM圖Fig.2 SEM images of corn starch before and after fermentation at different magnification scales

圖3 發(fā)酵前后玉米淀粉的XRD圖Fig.3 XRD images of corn starch before and after fermentation

此外，本研究中優(yōu)化后的油脂產(chǎn)量低于優(yōu)化前，可能是由于單因素試驗(yàn)所選用的發(fā)酵容器為500 mL的三角瓶，正交試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)所選用的發(fā)酵容器為250 mL三角瓶，導(dǎo)致通氣量不同所致。正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果表明裝料量對(duì)油脂產(chǎn)量影響極顯著，即通氣量將影響油脂產(chǎn)量。

通過分析發(fā)酵前后玉米淀粉物理結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，固態(tài)發(fā)酵使得玉米淀粉顆粒被腐蝕，小顆粒淀粉增多，且晶型結(jié)構(gòu)消失。閔偉紅等［12］研究表明，淀粉結(jié)構(gòu)的改變會(huì)相應(yīng)地引起淀粉化學(xué)性質(zhì)的改變。對(duì)發(fā)酵前后的底物進(jìn)行化學(xué)分析，結(jié)果證實(shí)發(fā)酵降低了底物中總淀粉和直鏈淀粉的含量，同時(shí)底物中NDF和ADL含量也降低，但還原糖和蛋白質(zhì)濃度升高。據(jù)此推測(cè)，深黃被孢霉可能通過水解玉米淀粉和降解麩皮中NDF和ADL使得還原糖濃度升高，同時(shí)，還與底物中的含氮物一起合成菌體蛋白，因此蛋白質(zhì)濃度亦升高。

4 結(jié)論

①利用深黃被孢霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)油脂，最適的發(fā)酵底物為玉米淀粉和麩皮的混合物;獲得的最佳發(fā)酵條件為 A2B3C3D3，即玉米淀粉∶麩皮為1∶3、含水量 60%、接種量 30%、250 mL 裝料量60 g，其中含水量和裝料量對(duì)油脂產(chǎn)量影響極顯著。

②本研究所獲得的發(fā)酵產(chǎn)物中油脂含量達(dá)到了102 g/kg DM，總能從發(fā)酵前的15.81 MJ/kg DM提高到了20.44 MJ/kg DM，并對(duì) PUFAs有提高趨勢(shì)。

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