飼料磷水平對草魚形體的影響及其骨骼畸形的判定

肖順應 葉元土蔡春芳 金素雅 朱 磊 姚仕彬 姚林杰

(蘇州大學基礎醫學與生物科學學院，江蘇省水產動物營養重點實驗室，蘇州 215123)

飼料磷在魚體形體上主要表現在對骨骼系統的影響，如出現骨骼鈣化不全、骨骼形變以及脊椎側彎、鰓蓋殘缺等現象。Uyan等［1］研究發現，在給牙鲆飼喂低磷飼料后，試驗前期鰓蓋及骨組織的微結構已經發生變化。Sugiura等［2］和Baeverfjord等［3］在試驗中也觀察到了磷缺乏導致的由鰓蓋畸變到骨骼形變的過程。本試驗擬在純化飼料中添加不同濃度的磷酸二氫鈣，旨在研究飼料磷水平對草魚形體的影響，并對魚體的骨骼畸形狀況進行判定。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

草魚(Ctenopharyngodon idellus)幼魚由江蘇省蘇州市相城區特種水產養殖場提供，磷酸二氫鈣由無錫華諾威動物保健品有限公司提供，酪蛋白、糊精、明膠、羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、無水氯化鈣購于國藥集團化學試劑有限公司，玉米淀粉購于江蘇省蘇州市蓮花五區農貿市場。

1.2 試驗飼料

根據草魚的配合飼料營養標準(SC/T 1024—1997)設計配方，在以酪蛋白、豆油、淀粉、糊精和纖維素為原料的純化飼料中分別添加0、13、29、45、61、77 g/kg磷酸二氫鈣，試驗飼料組成及營養水平見表1。飼料原料經粉碎過60目篩，混合均勻，用小型面條加工機加工成1.5 mm粗細的條狀料，電風扇條件下干燥后再手工搓碎，篩選3～4 mm長的顆粒飼料置于冰箱中4℃密封保存。

1.3 飼養管理

試驗草魚初始平均體重為22.29 g，為池塘養殖的1冬齡魚種。試驗魚經1周暫養、馴化后，選擇體格健壯、規格整齊的魚種270尾，隨機分為6個組，每組設3個重復，每個重復放魚15尾，分別投喂飼料Ⅰ～Ⅵ。正式養殖試驗持續75 d。

養殖設施為室內養殖系統，單缸直徑70 cm，養殖容積0.23 m3，以曝氣自來水為水源，使用間歇性控電開關調節水體，每進水20 min關閉40 min，反復循環，缸內出水直接排走。定期使用水博士水質測定盒測量水質。養殖期間水質條件為:水溫20～26℃、溶解氧含量在6.0 mg/L以上、pH 7.0 ～7.4、氨氮含量 0.20 ～0.40 mg/L、亞硝酸鹽氮含量0.05～0.10 mg/L。試驗飼料于每天08:00、12:00、17:30各投喂1次，投喂量為各試驗組魚體體重的2%～3%。

表1 試驗飼料組成及營養水平(干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis) g/kg

1.4 樣品采集與分析

養殖試驗開始前，取10尾草魚測定魚體體重、體長、吻－鰓蓋長。養殖試驗結束時，從每個養殖缸中隨機取8尾魚測定魚體體重、體長、吻－鰓蓋長，計算體長特定生長率、吻－鰓蓋長/體長(吻端至鰓蓋末端長與體長的比值)以及肥滿度;每組隨機取魚3尾用X光機進行魚體骨骼的觀察。

1.5 數據處理與分析

試驗結果用SPSS 17.0軟件進行統計分析，數據以平均值±標準差表示，采用Duncan氏多重比較檢驗組間差異，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 對草魚體長特定生長率的影響

由表2可知，草魚體長特定生長率最高的是Ⅲ組，達到 0.65%/d，顯著高于Ⅰ、Ⅱ組(P ＜0.05);最低的是Ⅰ組，為0.34%/d，顯著低于除Ⅱ組外的其他試驗組(P＜0.05);其余各試驗組間沒有顯著性差異(P＞0.05)。上述結果說明當飼料磷酸二氫鈣水平低于29 g/kg時，體長特定生長率隨飼料磷水平的增加而升高，當磷酸二氫鈣水平高于45 g/kg時，體長特定生長率保持比較穩定的狀態。

表2 各試驗組草魚的體長特定生長率、吻－鰓蓋長/體長和肥滿度Table 2 The specific growth rate of length，snout-gill cover length/body length and condition factor of grass carp in different experimental groups

2.2 對草魚肥滿度的影響

由表2可知，飼料磷水平對草魚的肥滿度沒有顯著影響(P＞0.05)，但以Ⅲ組的肥滿度最高，為2.00%。這說明當飼料中磷酸二氫鈣的水平為29 g/kg時，草魚能獲得較高的肥滿度。

2.3 對吻－鰓蓋長/體長的影響

由表2可知，各試驗組草魚的吻－鰓蓋長/體長沒有顯著差異(P ＞0.05)，均在 0.26 ～0.28 范圍內。這說明飼料磷水平對草魚鰓蓋骨的發育沒有造成顯著的影響，沒有出現因磷的缺乏或者過量而導致的鰓蓋骨畸形情況。

2.4 對草魚畸形程度的影響

在養殖的過程中，試驗魚沒有出現諸如出血等體表受傷的病狀。養殖試驗結束后，肉眼觀察可發現部分魚的骨骼出現了畸形，畸形的主要部位在魚的尾柄。各試驗組草魚在X射線照射下的骨骼狀況見圖1。

由X射線照射結果可知，飼料中磷水平對6個試驗組的草魚頭骨沒有明顯的影響，肉眼不能觀察到頭骨出現畸形的狀況。飼料磷水平對草魚脊椎骨有明顯的影響，主要表現為引起了草魚脊椎骨的變形，發生脊椎骨彎曲的部位約在脊椎骨末端1/5處。由X線片及采樣時的觀察可知:Ⅰ組草魚的脊椎骨在肉眼和X射線下觀察都沒有發現明顯的畸形情況(圖1－Ⅰ);Ⅱ和Ⅲ組草魚的脊椎骨在肉眼觀察時基本沒有發現明顯的畸形情況，但是在X射線下觀察時發現部分魚的脊椎骨已經有了一定的畸形情況(圖1－Ⅱ和圖1－Ⅲ);Ⅳ組草魚的脊椎骨在肉眼觀察時可見部分魚的尾部稍微有些上翹，在X射線下觀察時發現部分魚的脊椎骨已經有了一定的畸形情況(圖1－Ⅳ);Ⅴ和Ⅵ組草魚的脊椎骨在肉眼觀察時就能發現一些草魚尾部上翹，尤其是Ⅵ組草魚尾部已經嚴重彎曲上翹，在X射線下觀察時發現尾部脊椎骨也有了畸形的情況(圖1－Ⅴ和圖1－Ⅵ)。由此可以判斷:Ⅰ組草魚沒有出現畸形或者畸形的程度不嚴重，肉眼還不能準確判斷;Ⅱ和Ⅲ組草魚已經開始出現輕微的畸形，因為畸形的程度不嚴重，所以只能在X射線條件下觀察到脊椎骨的畸形而不能肉眼識別體形的不正常，畸形的程度只視為輕度畸形;Ⅳ組草魚已經開始出現畸形，肉眼能識別出體形的不正常，在X射線條件下可觀察到脊椎骨的畸形，畸形的程度可視為中度畸形;Ⅴ和Ⅵ組草魚出現的畸形情況比較嚴重，不只是脊椎骨出現明顯的畸形情況，就連魚體的外表形態也發生明顯的畸形變化，并可通過肉眼觀察判斷，可視為重度畸形。

3 討論

魚類在生長發育過程中，魚體會發生一系列結構和功能上的變化。魚類在發育的過程中容易出現骨骼的非健康狀態，骨骼的發育畸形包括脊柱側凸、脊柱前彎、鰓蓋彎曲、尾椎畸形和頜畸形等，同時，出現畸形的魚往往生長緩慢、抗病能力弱［4］。影響魚類骨骼發育的因素主要有飼料中鈣、磷、維生素及氨基酸含量以及脂肪的含量和種類等。Geurden 等［5－6］研究報道，不同類型的磷脂對鯉魚的生長和發育有不同的影響，卵磷脂具有促生長的作用，而肌醇酸磷脂則能顯著降低骨骼畸形。陳彥等［7］的研究表明，磷脂及其代謝產物能提高作為生物膜Ca2+轉運系統重要組成部分的Ca2+-ATP酶的活性，Ca2+-ATP酶不僅參與骨組織有機質的鈣化，還直接參與成骨細胞向骨組織的分化，是決定骨骼正常發育的重要因素。Gapasin等［8］研究報道，投喂添加高不飽和脂肪酸的飼料能顯著降低比目魚的鰓蓋畸形率，其鰓蓋畸形率由未添加時的27.3% ～33.5%降低到了添加后的15.8% ～23.5% 。Gapasin［9］報道，二十二碳六烯酸(DHA)和維生素C都能影響比目魚骨骼的發育，投喂添加DHA的飼料后比目魚的畸形率由33%降低到了17%，而投喂添加DHA和維生素C飼料后比目魚的畸形率只有8.4% ～13.7%。Dedi等［10］報道，在日本比目魚飼料中添加高劑量的維生素A后，比目魚的生長速度降低，出現脊柱彎曲、椎骨縮短等骨骼畸形情況。Takeuchi等［11］在比目魚飼料(車輪蟲)中添加幾種維生素A后，比目魚出現了嚴重的骨骼畸形。Dabrowski［12］研究報道，鯉魚飼料中缺乏維生素C時會出現脊柱側凸、鰓絲扭曲、鰓蓋變短等畸形的癥狀。Dabrowski等［13］研究表明，維生素C缺乏會引起鯉魚幼苗鰓弓變形和尾鰭腐爛。Hilomen-Garcia［14］報道，當飼料中維生素C缺乏時，會影響比目魚鰓蓋的發育，從而導致比目魚的鰓蓋膜裂開。Akiyama等［15］報道，色氨酸缺乏將會引起紅馬哈魚、虹鱒魚、大馬哈魚和銀大馬哈魚的脊柱側凸，色氨酸能有效治愈大馬哈魚的骨骼畸形。

圖1 各試驗組草魚的X線片Fig.1 X-ray film of grass carp in different experimental groups

在已有的文獻中，研究的主要方向都是營養素對魚類骨骼發育的影響，一系列營養素的缺乏或過量可能會引起骨骼系統的畸形，尤其是脊椎骨的畸形;而對于魚體畸形的判定主要是通過肉眼的觀察，看其與正常魚體的形態特征是否有差別來加以判斷。在本試驗中出現了肉眼觀察魚體體形正常，但在X射線條件下觀察魚體脊椎骨已經出現了一定程度畸形的現象。因此，對魚體畸形情況的判定標準對科研試驗的進行具有很大的指導意義。本文把魚類的骨骼畸形程度作以下的區別。

健康魚體:通過肉眼觀察魚體體形正常，在X射線或其他方式條件下直接觀察脊椎骨形態正常的魚體為健康魚體。

輕度畸形:通過肉眼觀察魚體體形正常，在X射線或其他方式條件下可直接觀察到脊椎骨在某一點開始偏離脊椎骨主軸，但魚體體形仍基本保持正常，與主軸之間形成一定的角度，當角度低于時20.0°時，認為該尾魚為輕度畸形，如圖2－A所示。

中度畸形:通過肉眼可觀察到魚體的尾柄已經出現了一定程度的畸形，在X射線或其他方式條件下可直接觀察到脊椎骨在某一點開始偏離脊椎骨主軸，并與主軸之間形成一定的角度，角度大小在 20.0°～45.0°時，認為該尾魚為中度畸形，如圖2－B所示。

重度畸形:通過肉眼可觀察到魚體體形已經出現了嚴重的畸形，在X射線或其他方式條件下可直接觀察到脊椎骨某點偏離主軸角度大于45.0°，或者出現不止一次的偏離主軸時，認為該尾魚為重度畸形，如圖2－C所示。

圖2 草魚骨骼畸形圖示Fig.2 Graphical representation of grass carp bone deformity

在本試驗中，Ⅰ組草魚形體健康，沒有發現畸形情況;Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組草魚出現了輕度或者中度畸形的情況;Ⅴ和Ⅵ組草魚出現了重度畸形情況。在形態學上，魚類的骨骼包括頭部膜骨、體內骨骼和鱗片。在本試驗中，從形態學觀察來看，養殖結束后魚體的頭骨、鰓蓋骨及鱗片沒有發現異常現象，但是飼料含磷量高的組出現了尾柄畸形的情況，從X射線下觀察脊椎骨可知高磷組草魚的畸形情況比較嚴重，而低磷組草魚脊椎骨反而正常，這與眾多研究中認為飼料中磷含量偏低會引起魚體骨骼畸形的觀點相悖。這可能是因為，在養殖過程中，低磷組草魚的攝食率偏低，攝入的磷酸二氫鈣含量低于高磷組草魚，又由于純化飼料的適口性較差，硬度較大，不利于魚體對營養物質的吸收利用，從而阻礙了魚體的生長，因此低磷組草魚的生長性能不好，畸形情況沒有體現出來，而高磷組草魚攝入了過量的磷酸二氫鈣，從而導致了魚體的畸形。

4 結論

①本試驗條件下，飼料中磷酸二氫鈣添加過量(超過29 g/kg)時容易影響草魚形體發育，導致魚體骨骼的畸形。

②按魚體的脊椎骨畸形情況可以把草魚形體分為4個等級(健康魚體、輕度畸形、中度畸形和重度畸形)，魚體脊椎骨的畸形情況可作為飼料磷水平的一個判斷標準。

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