蘇木素在真菌性角膜炎診斷中的應用

吳勝哥

真菌性角膜炎是我國常見的致盲眼病。近年來，真菌性角膜炎發病率不斷上升，部分地區成為首位感染性眼病［1-3］。真菌性角膜炎的確診一般依靠涂片細胞學和真菌培養為主［4］。真菌培養是真菌性角膜炎診斷的“金標準”［4-5］，但真菌培養時間長，等待結果往往延誤治療［5］。傳統KOH濕片法檢查真菌性角膜炎的診斷陽性率低，誤診率高。如何快速準確地診斷真菌性角膜病是目前研究的熱點［4］。本研究收集2006年6月至2011年6月期間臨床診斷為真菌性角膜炎病例59例，研究蘇木素在真菌性角膜炎早期診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 我院2006年6月至2011年6月期間臨床診斷為真菌性角膜炎病例，59例患者中男36例，女23例;右眼31例，左眼28例;年齡15～67歲，平均49.3歲;農民38例，工人13例，其他8例;眼外傷史51例，引起外傷的異物為植物性(谷物、草、木頭、竹子、樹葉等)31例，土壤14例，焊屑9例，其他5例;3例既往有使用糖皮質激素、免疫抑制劑病史。

1.2 方法

1.2.1 角膜刮片操作方法 倍諾喜表面麻醉，75%酒精消毒眼周皮膚，開瞼器開瞼，用消毒手術刀刮取角膜潰瘍表面、周邊部及基底部物質，標本涂片行蘇木素染色和KOH濕片法查找真菌，并行真菌培養。

1.2.2 KOH濕片法查找真菌 取適量角膜潰瘍刮取物涂片于載玻片上，盡量將刮取物薄層鋪開，滴加10%氫氧化鉀1滴，蓋上蓋玻片，放置10 min，使雜質溶解，顯微鏡下先用低倍鏡找到標本位置，再用高倍鏡查找菌絲和孢子。

1.2.3 蘇木素染色查找真菌 取適量角膜潰瘍刮取物涂片于載玻片上，滴加蘇木素20 μl，盡量將刮取物薄層鋪開，蓋上蓋玻片，放置5 min染色，顯微鏡下先用低倍鏡找到標本位置，再用高倍鏡查找菌絲和孢子。

1.2.4 真菌培養 取適量角膜潰瘍刮取物接種于沙氏培養基試管，斜面朝上，25℃溫箱孵育培養3～21 d，觀察有無真菌生長，根據菌落的外觀、生長速度、菌絲、孢子或菌細胞形態特征等進行菌種鑒定。

1.3 數據收集及統計學處理 以真菌培養結果作為確診真菌性角膜炎的“金標準”。計算蘇木素染色法和KOH濕片法查找真菌的陽性率、靈敏度、特異度、假陽性率、假陰性率、正確指數、陽性預測值和陰性預測值。

2 結果

KOH濕片法真菌菌絲顯示為近透明條索狀結構，與背景對比度差(圖1-A)。蘇木素染色后真菌菌絲顯示為藍色管腔狀結構，與背景對比度強(圖1-B)。59例真菌性角膜炎病例中47例檢出真菌，陽性率79.66%。蘇木素染色法查找真菌陽性率64.40%，靈敏度74.46%，特異度42.86%，假陽性率25.00%，假陰性率25.53%，正確指數17.32%，陽性預測值92.11%，陰性預測值42.85%。KOH濕片法查找真菌陽性率45.76%，靈敏度 44.68%，特異度 18.75%，假陽性率50.00%，假陰性率55.32%，正確指數-36.57%，陽性預測值77.78%，陰性預測值18.75%。

圖1 涂片查找真菌(100，A:KOH濕片法，B:蘇木素染色法)

3 討論

真菌性角膜炎是嚴重的致盲眼病，早期診斷、早期治療對視力預后有決定性的影響。真菌性角膜炎的確診需依靠實驗室檢查［4］。本研究發現蘇木素染色法查找真菌的靈敏度、特異度、陽性率、正確指數、陽性預測值、陰性預測值均高于KOH濕片法;蘇木素染色法查找真菌的假陽性率、假陰性率均低于KOH濕片法。診斷試驗的真實性包括靈敏度和特異度。靈敏度即真陽性率，指的是診斷試驗能將實際患病的病例正確地判斷為患病的能力。特異度即真陰性率，是指診斷試驗能將實際未患某病的病例正確地判斷為未患病的能力。正確指數(約登指數)=靈敏度+特異度-1。靈敏度、特異度越高，診斷試驗的正確指數愈高，則該試驗的真實性愈高。本研究發現蘇木素染色法查找真菌的靈敏度、特異度和正確指數均高于KOH濕片法查找真菌，這說明蘇木素染色法查找真菌的真實性更高。陽性預測值是指診斷試驗陽性的病例中真陽性的比例;陰性預測值是指試驗陰性的病例中真陰性的比例。研究人群患病率水平對診斷試驗陽性預測值的影響卻很大。本研究人群為臨床診斷真菌性角膜炎病例，這屬高危人群，診斷試驗的陽性預測值較高。本研究發現蘇木素染色法查找真菌的陽性預測值高于KOH濕片法查找真菌，達92.11%。這說明蘇木素染色法查找真菌陽性的病例患真菌性角膜炎的可能性很大，這可用于指導臨床早期治療。假陽性率指診斷試驗將實際未患病的病例錯誤判斷為患病的能力，即為誤診率。假陰性率是指診斷試驗將實際患病的病例錯誤判斷為無病的能力，即為漏診率。本研究發現蘇木素染色法查找真菌的假陽性率、假陰性率均低于KOH濕片法查找真菌。這說明蘇木素染色法查找真菌的誤診率和漏診率均較低。

蘇木素是臨床病理最常用的染色劑之一，價格便宜，易于獲得。蘇木素是從洋蘇木中提取的一種染色劑，能夠在使細胞核染色。蘇木素為紫色液體，可將菌絲、孢子染色紫色，增強與背景的對比度，使菌絲和孢子易于被檢出，從而提高了診斷試驗的靈敏度、陽性率、陽性預測值;且染色后的菌絲與角膜纖維、雜質易于區分，提高了診斷試驗的特異生、陰性預測值。

影響真菌涂片檢出率的因素。①蘇木素染液蘇木素染液久置后會產生沉淀，過濾后染色，這可減少由于染液沉淀造成假陽性的出現，減低誤診率。②標本采集當刮片中真菌數量少時，蘇木素染色檢出率就下降［4-5］。由于真菌生長多位于潰瘍周邊部及底部，但潰瘍中央的白色粘性物質往往是菌絲叢，角膜標本少，采集的標本時連潰瘍中央的白色粘性物質一起采聚后直接涂片可提高真菌涂片的檢出率。③涂片過厚涂片過厚時，標本重疊不利于鏡下觀察判斷，涂片標本應在染色液中盡量分散開，必要時在蓋玻片上加壓促進團塊狀物質分散。

隨著角膜接觸鏡的普及以及廣譜抗生素、激素、免疫抑制劑的廣泛使用，真菌性角膜炎的發病率不斷增高。真菌性角膜炎早期、快速、有效的診斷方法是目前研究的熱點［1，2，4］。激光共焦顯微鏡和PCR技術在真菌性角膜炎診斷領域中展示了良好的應用前景，但其價格昂貴，目前還不能普及應用［6-8］，且有許多問題有待進一步研究。蘇木素染色法價格便宜，查找真菌幾分鐘便可出結果，靈敏度高，陽性預測值高，是真菌性角膜炎早期診斷簡單、快速、有效的方法。

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