巰基殼聚糖性能的體外評價*

呂占國 王立強

1.解放軍第二○二醫院，遼寧沈陽110016；2.華僑大學分子藥物學研究所，福建泉州362021

目前，藥學研究中廣泛應用合成的巰基殼聚糖(TGA)是一種新型的膜黏性聚合物，生物相容性和黏附性好是其最大特點。在未來藥用輔料的應用中，巰基殼聚糖作為一種功能性敷料應用前景十分廣闊[1]。目前國外對巰基殼聚糖的研究表明，合成方法所得產物中巰基的最大含量僅為0.36%[2]。本研究嘗試巰基殼聚糖不同的合成方法。結果表明，新的合成方法所得產物中的巰基最大含量達到7.56%，顯著提高其黏附性和功能性。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

巰基殼聚糖相對分子質量為（1.0～4.0）×105，巰基含量(%，w/w)為0.32%～7.56%，由本單位自制，批號091123。母雞蛋白溶菌酶由中山大學生命科學學院提供。其他試劑均購買于沈陽市化學試劑公司。

1.2 儀器

采用日本島津公司生產的FTIR-8201紅外光譜和UV-160A紫外可見光譜儀，DELTA-320-S pH劑（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；熒光顯微鏡（Hitachi，日本）。

1.3 考察溶脹性能

溶脹性能主要體現在吸水能力上，本方法通過重量法來測定溶脹性能[3]。分別取30 mg不同巰基含量的凍干巰基殼聚糖和對照品均勻壓成平片，每片直徑為5.0 mm。在制備平片的過程中保持壓力不變。在釘上將平片固定，放進磷酸鹽緩沖液（37℃ pH6.0的100 mmol/L）中吸水溶脹。從孵化介質中取出釘上的溶脹測試片，用重量法在預定的時間間隔內測試其吸水量。

1.4 分析

通過溶菌酶降解殼聚糖和巰基殼聚糖[5]，將400 mg殼聚糖在2.6 mL（0.1M）鹽酸和7.4 mL去離子水中溶解，得到的3%殼聚糖溶液再用離子水對其進行透析，調節pH值至5.0。同時，新配制100 mmol/L的醋酸鹽緩沖液，制備濃度為3%的凍干巰基殼聚糖溶液，pH調至5.0。然后將雞蛋白溶菌酶分別加入各個樣品中，使其最終濃度達到2.0 mg/mL。取1 mL混合物，用錐板式黏度計在（25.0±0.5）℃時測其在預定時間內的黏度。錐板式黏度計連接到設置分析參數的電腦后，通過the Phoe Win Pro 2.64程序來處理實驗過程和數據記錄[5]。通過同樣方法為對照品（不含溶菌酶的聚合物）進行分析。

2 結果

2.1 溶脹性能考察

片劑（30 mg），未經修飾的對照品殼聚糖鹽酸鹽（■）、巰基殼聚糖（巰基含量0.32%）（●）、巰基殼聚糖(巰基含量1.31%)（▲）、巰基殼聚糖(巰基含量5.56%)（▼）在100 mmol/L，pH6.0，37℃磷酸鹽緩沖液中的溶脹過程。與未經修飾的殼聚糖鹽酸鹽溶液相比較，三個實驗組均顯示顯著性差異（P＜0.01）。見圖1。

圖1 經修飾殼聚糖與未經修飾殼聚糖在磷酸鹽緩沖液中的溶脹過程比較

2.2 殼聚糖和巰基殼聚糖的降解結果比較

至少通過4個實驗取標準偏差值。與未經修飾的殼聚糖鹽酸鹽溶液相比較，4個實驗組差異均有統計學意義（P＜0.01）。見圖2。

圖2 比較溶菌酶對殼聚糖和巰基殼聚糖的降解

3 討論

如圖1所示，受試片在水中的水化過程中表現出較高的黏結性和穩定性，相比對照組TGA的鍵合對殼聚糖的溶脹行為沒影響。相反，修飾、未透析的殼聚糖－鹽酸鹽的溶脹行為與未修飾的殼聚糖－鹽酸鹽的對照底物相比存在差異。形成這種差異的原因被認為是殼聚糖的構象在和1%氯化鈉溶液和酸溶液中透析時發生了變化。

從圖2中可見，溫度是影響殼聚糖自動降解的唯一因素，通常在25℃進行降解研究操作。在加了溶菌酶后，殼聚糖在經修飾和經修飾兩種情況下，其黏性減少程度非常相似，60 min內測得2種形式的殼聚糖黏度均減少了60%。在人體內各種體液和組織中都能找到這種能降解殼聚糖的溶菌酶，例如血清、眼淚和黏膜中[6]。降解速度受偶合率的影響，偶合率越高則降解越慢。因為TGA對酶有抑制作用，溶菌酶的活性在巰基殼聚糖中降低，加酶的偶合物比未經修飾聚合物的降解速度慢，可能是由于酶中二硫鍵與聚合物的巰基相互作用的結果。

巰基殼聚糖在新反應條件下合成后，巰基含量顯著提高，其膜黏性、溶脹性等也同時隨著巰基含量的增加而提高。盡管在現有條件下經過化學修飾，但是所得產物的可降解性改變卻不是十分明顯，預示著巰基殼聚糖既有良好的生物相溶性，同時具有安全性，這個發現具有一定的特殊意義。

[1]Bernkop SA,Schwarz V,Artursson P，et al.Polymers with thiol groups:a new generation of mucoadhesive polymers?[J].Pharm Res,2004,16(6)：876-881.

[2]Bernkop SA,Steininger S.Synthesis and characterisation of mucoadhesive thiolated polymers [J].Int J Pharmaceutics,2000,194(2)：239-247.

[3]Snyder GH,Reddy MK,Cennerazzo MJ,et al.Use of local electrostatic environments of cysteines to enhance formation of a desired species in a reversible disulfide exchange reaction[J].Biochim Biophys Acta，2003,749(219)：26.

[4]Artursson P,Lindmark T,Stanley S,et al.Effect of chitosan on the permeability of monolayers of intestinal epithelial cells[J].Pharm Res,2004,11(9)：1358-1360.

[5]Illum L，Farraj NF，Davis SS.Chitosan as a novel nasal delivery system for peptide drugs[J].Pharm Res， 2001,23(9)：48-51.

[6]Bernkop SA,Biebel RG,Scholler S.Development of controlled drug release systems based on thiolated polymers[J].J Controll Rel,2000,166(1)：39-48.