地黃飲子對慢性腦低灌注大鼠學習記憶及海馬基質金屬蛋白酶-2、基質金屬蛋白酶-9的影響※

李瑞杰 白黎明 張嘵雙

(河北省新樂市中醫院中風病科，河北 新樂 050700)

地黃飲子對慢性腦低灌注大鼠學習記憶及海馬基質金屬蛋白酶-2、基質金屬蛋白酶-9的影響※

李瑞杰 白黎明1張嘵雙2

(河北省新樂市中醫院中風病科，河北 新樂 050700)

目的 探討地黃飲子對慢性腦低灌注大鼠學習記憶及海馬基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的影響。方法 將50只SD大鼠隨機分為假手術組、模型對照組、地黃飲子大劑量組、地黃飲子小劑量組及養血清腦顆粒組，每組各10只。采用雙側頸總動脈結扎制作大鼠慢性腦缺血模型，假手術組同樣分離雙側頸總動脈，但不予結扎。每日灌胃給藥1次，給藥容積10 mL/kg，地黃飲子大、小劑量組分別為20、10 g/kg，養血清腦顆粒為2 g/kg，連續8周。假手術組和模型對照組灌胃等容積蒸餾水。采用Morris水迷宮法進行大鼠學習記憶功能的測定。并免疫組織化學法測定MMP-2、MMP-9表達。結果 以大鼠逃避潛伏期和跨越平臺次數代表學習記憶能力，逃避潛伏期越短，跨越平臺次數越多，記憶能力越強。模型對照組逃避潛伏期較假手術組長(P＜0.05)，跨越平臺次數較假手術組少(P＜0.05)，說明結扎雙側頸總動脈模型可導致學習記憶功能下降。與模型對照組比較，地黃飲子組、養血清腦顆粒組逃避潛伏期均縮短(P＜0.05，P＜0.01)，跨越平臺次數均增加(P＜0.05，P＜0.01)。與地黃飲子小劑量組比較，地黃飲子大劑量組、養血清腦顆粒組逃避潛伏期縮短(P＜0.05)，跨越平臺次數增加(P＜0.05)。模型對照組海馬組織MMP-2、MMP-9表達較假手術組增高(P＜0.01)。地黃飲子組、養血清腦顆粒組海馬組織MMP-2、MMP-9表達均低于模型對照組(P＜0.05，P＜0.01)。地黃飲子大劑量組海馬組織MMP-2、MMP-9表達低于地黃飲子小劑量組(P＜0.05)，養血清腦顆粒組海馬組織MMP-2、MMP-9表達低于地黃飲子大劑量組(P＜0.05)。結論 地黃飲子能改善慢性低灌注大鼠學習記憶力功能，可能與抑制炎癥反應及細胞凋亡有關。

地黃飲子;大鼠，SD;海馬，化學;疾病模型，動物;顱內動靜脈畸形，代謝;慢性病;腦缺血，代謝;再灌注損傷，代謝;基質金屬蛋白酶2;基質金屬蛋白酶9

慢性腦低灌注是各種原因引起的長期腦灌注不足，促使腦發生一系列病理生理改變，臨床主要表現為進行性的學習、記憶等認知功能障礙，是血管性癡呆、初老期癡呆(Alzheimer病)和皮層下動脈硬化性腦病(Bingswanger)等多種疾病發展過程中的一個共同病理過程。隨著年齡的增長，全腦或局部腦區慢性低灌注狀態成為一種較常見的狀態，在臨床中腦低灌注狀態得到了越來越多的認識和重視。地黃飲子具有滋腎陰、補腎陽、化痰開竅的功能，臨床上觀察到地黃飲子能夠有效改善患者慢性腦血流灌注不足的癥狀。本實驗旨在觀察地黃飲子對大鼠慢性腦低灌注的作用效果及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年雄性SD大鼠50只，體質量(250±20)g，SPF級，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK(陜)2007-001。飼養于陜西中醫學院中藥藥理學實驗室，溫度25℃，濕度45%。自由飲水，每日光照4 h。

1.1.2 實驗藥品及試劑 地黃飲子水煎液由陜西中醫學院中藥藥理研究室制備，地黃飲子按原方比例(熟地黃18 g，巴戟天、山茱萸、石斛、肉蓯蓉各 9 g，炮附子、五味子、肉桂、茯苓、麥門冬、石菖蒲、遠志各6 g，薄荷、生姜、大棗各3 g)配伍，加10倍量水浸泡2 h，煎煮40 min后過濾煎液，再加8倍量水煎煮40 min，過濾煎液，合并2次濾液，用旋轉蒸發儀濃縮至分別含生藥2 g/mL和1 g/mL的藥液后，無菌條件裝瓶，置4℃冰箱備用。養血清腦顆粒(天津天士力制藥股份有限公司，國藥準字Z10960082)。基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.1.3 實驗儀器 Morris水迷宮由中國醫學科學院治療所生產。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 50只SD大鼠，適應性喂養1周，隨機分為假手術組、模型對照組、地黃飲子大劑量組、地黃飲子小劑量組和養血清腦顆粒組，每組各10只。

1.2.2 模型制備 術前12 h禁食，4 h禁水。用水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司，國藥準字 H37022673)350 mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定，頸正中去毛，碘伏消毒，頸正中切開，仔細分離出雙側頸總動脈并結扎，假手術組同樣分離雙側頸總動脈，但不予結扎。縫合切口后回籠飼養，青霉素抗感染4 d。

1.2.3 給藥方法 每日灌胃給藥1次，給藥容積10 mL/kg，地黃飲子大、小劑量組分別為20、10 g/kg，養血清腦顆粒為2 g/kg，連續8周。假手術組和模型對照組灌胃等容積蒸餾水。

1.3 觀察指標及方法

1.3.1 于給藥后4、8周采用Morris水迷宮法進行大鼠學習記憶功能的測定。①定位航行試驗:歷時4 d，每日上、下午各2次，將大鼠面向池壁分別從4個入水點放入水中，記錄其在3 min內尋找到并爬上平臺的時間即逃避潛伏期。如果大鼠在3 min未找到平臺，則由實驗者用手牽引其至平臺上，讓大鼠停留10 s再放回籠中，潛伏期記為最高分180 s。分別在給藥后4、8周重新進行游泳實驗，大鼠每次在3 min內尋找到并爬上平臺的時間為大鼠的記憶成績，每日2次，連續4 d，計算平均成績。②空間探索實驗:第5 d撤除平臺，將大鼠任選1個入水點放入水中，測其2 min內跨越原平臺所在位置的次數。上、下午各1次，計算平均成績。

1.3.2 以大鼠逃避潛伏期和跨越平臺次數代表學習記憶能力，逃避潛伏期越短，跨越平臺次數越多，記憶能力越強。實驗結束后大鼠經心臟灌注固定后取腦，固定，梯度酒精中脫水，脫水后浸蠟包埋，行冠狀位連續切片，并將切片粘于多聚賴氨酸處理的載玻片上，烘干，免疫組織化學法測定 MMP-2、MMP-9。

1.4 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件包進行統計學分析，計量資料用均數±標準差(±s)表示，采用方差分析，組間采用t檢驗。

2 結果

2.1 地黃飲子對慢性腦低灌注大鼠學習記憶功能的影響見表1。

表1 地黃飲子對慢性腦低灌注大鼠學習記憶功能的影響±s

表1 地黃飲子對慢性腦低灌注大鼠學習記憶功能的影響±s

與假手術組比較，*P ＜0.05;與模型對照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與地黃飲子小劑量組比較，#P ＜0.05

組 別 n 劑量(g/kg) 逃避潛伏期(s)跨越平臺次數(次)4周 8周4周 8周假手術組 10 - 17.63 ±3.67 16.33 ±2.44 7.40 ±1.71 7.70 ±1.64模型對照組 10 - 47.30 ±7.66* 53.50 ±3.34* 3.00 ±1.41* 2.50 ±1.27*地黃飲子小劑量組 10 10 39.00±8.47△ 44.50±7.41△△ 4.30±1.16△ 4.00±1.05△地黃飲子大劑量組 10 20 34.30±7.35△△# 36.30±8.12△△# 4.80±1.23△# 4.50±1.2△△#養血清腦顆粒組 10 2 31.60±8.02△△# 34.60±9.73△△# 5.00±1.49△# 4.70±1.42△△#

由表1可見，模型對照組逃避潛伏期較假手術組長(P＜0.05)，跨越平臺次數較假手術組少(P＜0.05)，說明結扎雙側頸總動脈模型可導致學習記憶功能下降。與模型對照組比較，地黃飲子組、養血清腦顆粒組逃避潛伏期均縮短(P＜0.05，P＜0.01)，跨越平臺次數均增加(P＜0.05，P＜0.01)。與地黃飲子小劑量組比較，地黃飲子大劑量組、養血清腦顆粒組逃避潛伏期縮短(P＜0.05)，跨越平臺次數增加(P＜0.05)。

2.2 地黃飲子對慢性腦低灌注大鼠海馬組織MMP-2、MMP-9的影響 見表2。

表2 地黃飲子對慢性腦低灌注大鼠海馬組織MMP-2、MMP-9的影響±s

表2 地黃飲子對慢性腦低灌注大鼠海馬組織MMP-2、MMP-9的影響±s

與假手術組比較，*P ＜0.01;與模型對照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與地黃飲子小劑量組比較，#P ＜0.05;與地黃飲子大劑量組比較，☆P ＜0.05

MMP-2 MMP-9假手術組 10 —組 別 n劑量(g/kg)2.92 ±0.79 2.25 ±0.87模型對照組 10 — 21.33±2.10* 21.58±2.11*地黃飲子小劑量組 10 10 19.58±2.50△ 19.75±1.76△地黃飲子大劑量組 10 20 17.67 ±1.92△△# 17.92 ±2.47△△#養血清腦顆粒組 10 2 15.75±2.01△△☆ 16.42±2.07△△☆

由表2可見，模型對照組海馬組織MMP-2、MMP-9表達較假手術組增高 (P＜0.01)。地黃飲子組、養血清腦顆粒組海馬組織MMP-2、MMP-9表達均低于模型對照組(P＜0.05，P＜0.01)。地黃飲子大劑量組海馬組織MMP-2、MMP-9表達低于地黃飲子小劑量組(P＜0.05)。養血清腦顆粒組海馬組織MMP-2、MMP-9表達低于地黃飲子大劑量組(P＜0.05)。

3 討論

全腦或局部腦區慢性低灌注是目前認為有認知功能障礙的老年人中比較常見的一種病理生理改變。很多資料顯示在低灌注狀態下，認知功能可發生減退［1］。有學者永久性結扎大鼠雙側頸總動脈制作出慢性腦缺血的動物模型，經證實這一模型能使Wistar大鼠術后數月腦血流仍明顯下降，不同腦區腦血流下降的程度不同。同時，由于大鼠Willis環發達，代償好，并沒有導致任何一個腦區血流灌注完全停止，接近臨床慢性腦低灌注的發病機制，是目前普遍認同的用于慢性腦低灌注研究的動物模型［2］。海馬、前額葉、顳葉及大腦皮層的神經元對缺血十分敏感，而這些區域神經元功能和結構的損害會造成與學習記憶相關的神經遞質紊亂［3］。基質金屬蛋白酶(MMPs)是一組鈣離子和鋅離子依賴的金屬蛋白內切酶家族，可以降解絕大部分細胞外基質(ECM)成分［4］。近年來，研究發現MMPs，尤其是MMP-9可以通過降解血腦屏障基底膜及緊密連接，參與腦缺血后血腦屏障的破壞［5］。血腦屏障的功能損害，不僅使水、電解質外流，也使大量的蛋白質外流，最終形成血管源性腦水腫，神經元損壞。同時活化的白細胞通過破壞了的血腦屏障滲出到腦組織內，釋放許多細胞因子、炎癥介質，加速神經元的死亡，加重缺血性腦損害［6］。另外，目前有研究表明MMP-9還與細胞凋亡有關［7］。

地黃飲子出自《黃帝素問宣明論方》，由熟地黃、巴戟天、山茱萸、石斛、肉蓯蓉、五味子等組成，具有滋腎陰、補腎陽、化痰開竅的功能。本研究結果表明，雙側頸總動脈永久性結扎可導致腦低灌注大鼠學習記憶能力減退，炎性介質的釋放，加速細胞凋亡。本實驗提示地黃飲子能明顯改善慢性腦低灌注大鼠學習記憶能力，減低慢性腦低灌注大鼠MMP-2、MMP-9的表達。提示地黃飲子具有一定保護神經元免受損傷，從而預防改善記憶減退的作用。此機制可闡釋該方的滋腎陰、補腎陽、化痰開竅的功效。本實驗同時發現在減低MMP-2、MMP-9的表達上地黃飲子大、小劑量組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，說明在改善慢性腦低灌注大鼠學習記憶能力、減低慢性腦低灌注上可能存在量效關系，且影響是多方面的。養血清腦顆粒是以宋代《太平惠民和劑局方》的四物湯為基礎加味并采用最新工藝研制而成的標本兼治的制劑，在臨床上廣泛應用于因慢性腦供血不足(CCCI)引起的頭暈、頭痛等，故本實驗選用養血清腦顆粒作為陽性對照藥物，本實驗中將養血清腦顆粒組與地黃飲子大劑量組進行比較，發現兩者之間差異有統計學意義(P＜0.05)，養血清腦顆粒組優于地黃飲子原方組，說明在臨床應用上地黃飲子原方應進一步改進研究，以待提高。

［1］毛玲，查運紅，黃敬，等.慢性全腦低灌注大鼠血腦屏障的改變及MMP-9表達的實驗研究［J］.卒中與神經疾病，2007，14(1):32-36.

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Effect of Dihuangyinzi on learning and memory and MMP-2，MMP-9 of hippocampal matrix in rats with chronic cerebral hypoperfusion

LI Ruijie*，BAI Liming，ZHANG Xiaoshuang.*Department of Stroke，Xinle City Hospital of Hebei Province，Hebei Province，Xinle050700

ObjectiveTo observe the effect of Dihuangyinzi on learning and memory and MMP-2，MMP-9 of hippocampal matrix in rats with chronic cerebral hypoperfusion.MethodsFifty SD rats were randomly divided into sham operation group，model control group，Dihuangyinzi high-dose group，low-dose group Dihuangyinzi and Yangxueqingnao granule group(n=10).Rat model of chronic cerebral ischemia was established by the method of bilateral carotid artery ligation.Sham group

the same separation of bilateral common carotid artery，but not ligation，Dihuangyinzi high-，low-dose group were given 20，10 g/kg by gavage once a day，dose volume of 10 mL/kg.Yangxueqingnao granule received 2 g/kg，for 8 weeks.Sham operation group and model control group was given an equal volume of distilled water.Learning and memory function in rats were measured by Morris water maze.ResultsEscape latency of model control group was longer than that in the sham operation group(P＜0.05)，frequency of cross-platform was less than that in the sham group(P＜0.05).Escape latency in Dihuangyinzi highdose group，Dihuangyinzi low-dose group and Yangx-ueqingnao granule group were decreased in comparison with that in model control group(P＜0.05，P＜0.01).The frequency of cross-platform in these three groups were increased(P＜0.05，P＜0.01).Escape latency in Dihuangyinzi high-dose group and Yangxueqingnao granule group were decreased in comparison with that in low-dose group Dihuangyinzi group(P＜0.05).The frequency of cross-platform in these two groups were increased compared with that in Dihuangyinzi low-dose group(P＜0.05).MMP-2 and MMP-9 expression of hippocampus in model control group were increased in comparison with those in sham group(P＜0.01).MMP-2 and MMP-9 expression of hippocampus in Dihuangyinzi high-dose group，Dihuangyinzi low-dose group and Yangxueqingnao granule group were lower than those in model control group(P＜0.05，P＜0.01).MMP-2 and MMP-9 expression of hippocampus in Dihuangyinzi high-dose group and Yangxueqingnao granule group were lower than those in Dihuangyinzi low-dose group(P＜0.05).MMP-2 and MMP-9 expression of hippocampus in Yangxueqingnao granule group were lower than those in Dihuangyinzi high-dose group(P＜0.05).ConclusionDihuangyinzi can improve learning and memory in rat with chronic cerebral hypoperfusion，it may be related to inhibition of inflammation and apoptosis.

Rat;SD;Hippocampus;Chemistry;Disease model;Animal;Intracranial arteriovenous malformation;Metabolism;Chronic disease;Cerebral ischemia;Reperfusion injury;Matrix metalloproteinase

R289.5;R-331;R743.4;R977.6

A

1002-2619(2011)10-1551-04

※項目來源:陜西省教育廳科學研究計劃(2010JK488);陜西中醫學院校級課題(2009XJ-26);陜西省痰瘀論治中醫腦病重點研究室重點項目

1 陜西中醫學院臨床醫學院臨床教研室，陜西 咸陽 712046

2 陜西中醫學院藥理教研室，陜西 咸陽 712046

李瑞杰(1979—)，男，主治中醫師，碩士。從事中西醫結合治療腦血管病臨床和實驗研究工作。

2011-06-20)